盐酸瑞芬太尼的化学成分鉴定

盐酸瑞芬太尼的化学成分鉴定

盐酸瑞芬泰尼（remembertima）的化学特征为4-（甲基苯基）-4-[（n-1-羟色胺）苯基]-1-羟色胺盐酸盐，结构如图1所示。盐酸瑞芬太尼是一种新型的μ受体激动剂,其药效强,起效迅速,半衰期短,术中易于控制,术后患者苏醒快,是临床麻醉的理想药物之一。目前,该品种仅收载于国家药品标准,但尚未被国内外药典收载,迄今也只有少量文献报道。为了有效控制盐酸瑞芬太尼的质量,本文对其主要有关物质进行了更详细研究和结构鉴定。采用HPLC法分析盐酸瑞芬太尼及其有关物质,对其可检出的2个杂质进行分离纯化,分别用制备高效液相法分离获得杂质Ⅰ,定向合成法获得杂质Ⅱ,并运用LC-/MS、NMR、UV、IR等分析方法鉴定了结构,确定杂质Ⅰ、杂质Ⅱ分别为盐酸瑞芬太尼的N-脱烷基化合物和去甲氧基化合物。本研究为盐酸瑞芬太尼的质量控制提供了重要的依据。1仪器和试剂盒1.1色谱-质谱条件LC-20AB型高效液相色谱仪,包括LC-20AB型泵,SPD-20A型紫外检测器,SIL-20AC型自动进样器,LC-solution色谱工作站(日本岛津)。PerkinElmerSpectrumOne红外光谱仪,ShimadzuUV-160紫外分光光度计,Agilent6410B三重四级杆串联质谱仪,BrukerAvance300MHZ核磁共振仪。1.2甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙腈等色谱图件为分析纯水、超纯水的试剂盐酸瑞芬太尼原料药(由四川抗菌素工业研究所化学事业部提供,批号090901-090903,含量99.1%),甲醇、乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。2初步推测与羟基黄酮酸有关的杂质结构2.1盐酸瑞芬尼杂质的确认2.1.1流动相-甲醇-乙腈体系应用HPLC法检查盐酸瑞芬太尼中的有关物质,色谱条件如下:Kromasil-CN柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:0.03mol/L磷酸二氢钾(磷酸调至pH3.0)-甲醇-乙腈(80:16:4);检测波长:225nm;流速:0.8mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。从盐酸瑞芬太尼的HPLC色谱图(图2A)中可以看出,在盐酸瑞芬太尼主峰前存在2个杂质小峰,按出峰顺序,分别简称为杂质Ⅰ(相对保留时间0.73)和杂质Ⅱ(相对保留时间0.79)。2.2--m-6--3-菌株,3.通过LC/MS技术对盐酸瑞芬太尼及相关杂质的分子量进行测定。色谱条件:色谱柱:KromasilCN(4.6mm×250mm,5μm),流动相:0.01mol/L甲酸铵缓冲溶液(pH6.0)-甲醇(60:40),检测波长:225nm,流速:0.4mL/min,柱温:30℃。质谱条件:Agilent6104B三级四级杆串联质谱仪;电喷雾ESI离子源;检测模式:ESI(+);干燥气:10L/min;电压:120V。质谱显示:瑞芬太尼[M+H]+=377.2,杂质Ⅰ[M+H]+=291.2,杂质Ⅱ[M+H]+=363.3,由此得出各分子量为:M瑞芬太尼=376.2,M杂质Ⅰ=290.2,M杂质Ⅱ=362.3。根据LC/MS结果,结合盐酸瑞芬太尼的结构特点对2个杂质进行初步推测:(1)杂质Ⅰ的分子量比瑞芬太尼少86,可能为盐酸瑞芬太尼去丙酸甲酯降解产物。(2)杂质Ⅱ的分子量比瑞芬太尼少14,可能为盐酸瑞芬太尼18位上甲酯水解产物。3盐酸瑞芬太尼及其相关杂质的制备和结构评价3.1杂质的制备(1)杂质Ⅰ的制备用制备高效液相法分离、制备杂质Ⅰ。将盐酸瑞芬太尼样品适量置于坩埚内,放置185℃烤箱,变为橙黄色时取出,用流动相稀释成10mg/mL的溶液,取此溶液0.2mL,注入液相色谱仪。制备液相色谱条件为:色谱柱:Shim-packPREP-ODS(H)KIT,1.5×20cm;流动相:甲酸水(pH3.0)-乙腈(85:15);检测波长:225nm;流速:8.0mL/min;柱温:30℃;进样体积:0.2mL;多次收集保留时间14.5~16.5min的组分溶液(如图2B),合并收集溶液经减压蒸干即得杂质Ⅰ。(2)杂质Ⅱ的制备取盐酸瑞芬太尼约5g,加入100mL的1mol/L的NaOH,放置20min,加入盐酸中和。再加入90%乙醇50mL进行搅拌,结晶,过滤,进行真空干燥至恒重,得白色固体,即为杂质Ⅱ。3.2盐酸瑞芬太尼最重要的材料结构试验3.2.1碳化dept和13c-1hcosy将制备得到的杂质Ⅰ作LC/MS分析,杂质Ⅰ的分子离子峰[M+H]+为m/z291.2。进一步对盐酸瑞芬太尼与杂质Ⅰ作NMR分析比较,并结合LC-MS的结果,推断出杂质Ⅰ的结构,杂质Ⅰ为盐酸瑞芬太尼N-脱烷基化合物,其结构见图1。杂质Ⅰ的1H-NMR谱中,共有9组峰,22个氢。13C-NMR谱中,共有12组碳峰,有16个碳原子。结构确证数据及分析:m/z291[M+H]+。1H-NMRδ:0.81(t,J=7.39Hz,3H,CH3),1.76(q,J=7.37Hz,2H,CH2),1.38(m,2H,CH2),2.0(m,2H,CH2),2.63(m,4H,CH2),3.64(s,3H,-OCH3),7.34(t,J=6.63Hz,2H,CH),7.45(m,1H,CH),7.50(m,2H,CH)。13C-NMRδ:9.12(q,C-9),28.35(t,C-8),34.05(t,C-11,C-14),42.13(t,C-12,C-13),51.61(q,C-16),62.59(s,C-10),128,54(d,C-3),129.27(d,C-2,C-4),130.51(d,C-1,C-5),139.16(s,C-6),172.49(s,C-7),173.31(s,C-15)。1H-1HCOSY谱显示:δ0.81和δ1.76处2组共5个质子的多重峰为相关峰,其为丙酰胺基上的甲基和次甲基的质子峰;δ1.38、δ2.0、δ2.63处有3组各为2、2、4个质子的多重峰为相关峰,其为哌啶环上4个次甲基的质子峰;δ3.64处一组3个质子的单峰为甲氧基上的质子峰。δ7.34、δ7.45、δ7.50处有3组共5个质子的多重峰为相关峰,其为苯环上的质子峰。DEPT和13C-1HCOSY:在杂质Ⅰ的13C-NMR谱中,共有12组碳峰,分子中有4组对称的碳原子。从DEPT谱可知共有4组季碳峰、3组叔碳峰、3组仲碳峰和2组伯碳峰。在δC172.49、δC173.31处有两组羰基的季碳峰,为结构中1个酯羰基(C-15)和1个酰胺羰基(C-7);在δC51.61处有一组伯碳峰,在13C-1HCOSY谱中与δH3.64的质子峰相关,为羧基甲酯中甲氧基碳原子(C-16)的碳峰;在δC128,54、δC129.27、δC130.51、δC139.16处有1组季碳峰和3组叔碳峰,在13C-1HCOSY谱中分别与δH7.45、δH7.50、δH7.34的质子峰相关,为苯环上6个碳原子(C-3、C-2、C-4、C-1、C-5)的碳峰;在δC34.05、δC42.13、δC62.59处有1组季碳峰和2组仲碳峰,在13C-1HCOSY谱中分别与δH1.38、δH2.0、δH2.63的质子峰相关,为4位双取代哌啶环上5个碳原子(C-11、C-14、C-12、C-13、C-10)的碳峰;在δC28.35、δC9.12处有1组仲碳峰1组伯碳峰,在13C-1HCOSY谱中分别与δH1.76、δH0.81的质子峰相关,为丙酰胺上次甲基(C-8)和甲基(C-9)的碳峰。3.2.2内酰胺三s,4h,5,3.将制备得到的杂质Ⅱ作LC/MS分析,杂质Ⅱ的分子离子峰[M+H]+为m/z363.2。对杂质Ⅱ作NMR、UV、IR分析,并结合LC-MS的结果,推断出杂质Ⅱ的结构为盐酸瑞芬太尼18位碳甲酯水解产物,杂质Ⅱ的1H-NMR谱中,共有11组峰,26个氢。13C-NMR谱中,共有15组碳峰,有19个碳原子。其结构见图1。杂质Ⅱ结构确证:m/z:362.3[M+H]+。1H-NMRδppm:0.82(q,J=7.37Hz,3H,CH3),1.80(t,J=7.38Hz,2H,CH2),2.24~2.28(m,4H,CH2),2.49~2.51(m,4H,CH2),2.76(t,J=7.58Hz,2H,CH2),3.07~3.16(m,4H,CH2),3.14~3.16(m,2H,CH2),3.16~3.21(m,4H,CH2),11.10(s,1H,COOH),3.70(s,3H,-O-CH3),7.40(t,J=18.24Hz,2H,CH),7.33~7.36(m,1H,CH),7.49~7.51(m,2H,CH),12.68(s,-NHCl).13C-NMRδppm:9.10(q,C-9),28.27(t,C-16),28.51(t,C-8),29.97(t,C-11,C-14),48.77(t,C-12,C-13),50.92(t,C-15),52.70(q,C-19),59.82(s,C-10),129.06(d,C-3),129.60(d,C-2,C-4),130.42(d,C-1,C-5),138.26(s,C-6),171.37(s,C-17),173.31(s,C-18),173.31(s,C-7)。杂质Ⅱ紫外吸收光谱的最大吸收波长206.4nm,与盐酸瑞芬太尼的最大吸收波长206.8nm相比,没有明显差别。IR(KBr)cm-1:3010cm-1(VO-H),2978cm-1(VC-H),1596cm-1(VC=C)1493cm-1(VC=C),702cm-1(δC-H),1741cm-1(VC=O),1255cm-1(VC-O),1650cm-1(VC=O),1400cm-1(βO-H)。杂质Ⅱ与盐酸瑞芬太尼相比,结构上的变化主要是酯水解并形成一个羧基,杂质Ⅱ的13C-NMR图谱上共有15个碳信号(两对苯环上的芳基碳,两对哌啶环上的次甲基碳为对称结构),DEPT谱显示其中有3组-CH,5组-CH2,2组-CH3,5组-C的碳信号,比杂质Ⅰ多两组-CH2和一组-C;比盐酸瑞芬太尼少一个,即18位碳水解掉的甲基。从1H-NMR上可以看出杂质Ⅱ低场活泼氢信号为1个,为羧基上的氢。在杂质Ⅰ结构分析的基础上,杂质Ⅱ的1H-1HCOSY谱显示:δ3.14~3.16和δ2.76处有2组共4个质子的多重峰为相关峰,其为丙酸上2个次甲基的质子峰;δ11.10处有1个质子的单峰,为羧酸活泼氢的质子峰。在δC50.92、δC28.27、δC171.37处有2组仲碳峰,1组季碳峰,在13C-1HCOSY谱中分别与δH2.76、δH3.14~3.16的质子峰相关,为丙酸上2个次甲基(C-15和C-16)和羰基(C-17)的碳峰。4讨论4.1高温和高温条件下流动相分离试验发现杂质Ⅰ随温度增加含量增高,为了获取较高含量的杂质Ⅰ样品,降低分离难度,我们考察了盐酸瑞芬太尼不同高温破坏条件:分别为烘箱(150、160、170、180和185℃)加热破坏;有机溶剂中加热破坏;熔融破坏,结果表明在熔融(185℃)破坏条件下,杂质Ⅰ的色谱含量最大,最适宜分离获取。高温破坏样品产生杂质Ⅰ的色谱分析见图2C。制备液相条件参考2.1.1,发现流动相中加入甲醇,杂质Ⅰ出峰较晚,不利于组分收集,因此考虑在流动相中不加甲醇,通过调整甲酸水与乙腈的比例,结果表明当流动相比例:甲酸水:乙腈(85:15)时,杂质Ⅰ出峰较快,且与主峰及其杂质分离较好。还考察了流动相pH为6.0,5.0,4.0,3.0时的分离情况。结果表明当pH为3.0时,峰形较好,且杂质峰与主峰均基线分离。4.2碱破坏温度的影响杂质Ⅱ的增加与酸、碱、热破坏因素有关,碱破坏最为强烈,分别考察了碱浓度为0.5、1和2mol/LNaOH对杂质Ⅱ含量的影响,结果表明盐酸瑞芬太尼在强碱条件下,随着碱浓度的增加及放置时间的延长,杂质Ⅱ峰面积逐渐增加,1mol/L浓度以上碱破