抗菌制品抑菌效果检测及方法学研究

抗菌制品抑菌效果检测及方法学研究

随着社会的发展和生活水平的提高，各种能够抗菌功能的材料（如抗菌塑料、抗菌橡胶、抗菌纤维等）在近年来得到了开发和上市。由于该类抗菌产品的种类繁多,其外形、构造差别很大,加之其添加的有效抗菌成分品种、比例以及在制品中的分布的差异等诸多因素,使得该类制品的抗菌功能的检测变得十分复杂。本文通过大量的实验研究并参照《消毒技术规范》提出了适用于非溶出性抗菌产品的抑菌效果检测方法。1材料和方法1.1酶3-菌株5.2金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(25922);生理盐水;振荡摇床(200~300r/min);50ml三角烧瓶和营养琼脂培养基等。1.2温度和浓度为0.0.5%的温度,有6.(1)检样制备:①样品为固体状态,密度较小且抗菌成分均匀一致分布于待检样品中时,将抗菌物品剪切成10mm×10mm样片,称取2g分装待用。②样品为固体状态,密度较大或抗菌成分仅分布于样品表面时。将抗菌物品剪切成10mm×10mm样片,按表面积量取100cm2分装待用。③若待检样品为非固体形态,可直接称取2g或2m1分装备用。(2)将上述样片放入一50ml的三角烧瓶中,分别加入19.8ml(固体样品)或17.8ml(液体样品)生理盐水和0.2ml菌悬液,使菌液的工作浓度为1×104~2×104cfu/ml。(3)将三角烧瓶固定于振荡摇床上,以200r/min振摇2h。(4)分别取0.5ml振摇0h和振摇2h后的样液,或用盐水做适当稀释后(1∶10,1∶100,1∶1000或1∶10000等)的样液,以琼脂倾注法接种平皿,进行活菌培养计数。试验重复3次。(5)试验同时设阴性对照和空白对照组。除阴性对照组加入不含抗菌成分的材质、大小相同的样片代替抗菌样片,空白对照组不加任何样片外,其余操作程序均与试验组相同。(6)活菌培养计数法:吸取不同稀释度的样液各0.5ml加于无菌平皿内,一般需做2~3个稀释度,每一个稀释度做3个平皿。将冷至40~45℃的熔化营养琼脂培养基,倾注于已加入样液的平皿中,每平皿15~20ml,随即转动平皿,使样品与培养基充分混合均匀,待琼脂凝固后,翻转平皿,置37℃培养箱内培养48h。计数菌落时,以菌落数在30~300的平板为准,每个稀释度3个平板生长菌落数全合乎上述标准,则以该3个平板的菌落平均值作为结果;若有2个符合上述标准,则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果;若只有1个平板合格者,结果作废。当两个稀释度组均各有2个以上平板的菌落数在30~300个之间,应将该两稀释度计算出的菌落数的平均值作为结果。如果所有稀释度均没有2个以上平板生长的菌落数在30~300之间时,则该次试验作废。最后,将求得的平均菌落值,乘以2,再乘以稀释倍数,即得每毫升样液中的菌量。(7)按下式计算抑菌率。抑菌率=样本振荡前平均菌落数−样本振荡后平均菌落数样本振荡前平均菌落数×100%=样本振荡前平均菌落数-样本振荡后平均菌落数样本振荡前平均菌落数×100%1.3菌落数差值测定(1)不加样片组活菌计数在1×104~2×104cfu/ml。且样本振荡前后平均菌落数差值在10%以内,试验有效。(2)试验样片的抑菌率与对照样片的抑菌率的差值>26%,即可认定该样片具有抑菌作用。2结果与讨论2.1抗菌制品的制备对不同种类抗菌制品共12种进行了抑菌效果检测,结果表明(表1),虽然抗菌制品的种类不同,且其形态各不相同,但其对目标菌均有较强的抑制作用,当作用时间为2h时,其抑菌率均可达到80%以上。表1中可见同样数量的样品含量,由于样品状态的不同,其抑菌率却有所不同,以液体,半固体状态样品的抑菌率较高,固体次之,其可能原因除不同制品的有效成分含量可能有所不同外,另一个主要原因可能和制品中的有效成分与制品基质之间的构造有关。大多数无机抗菌剂是通过将抗菌成分和无机物载体结合而制得。所采用的抗菌成分主要有银、铜、锌及其化合物。在各种抗菌成分中,以银及其化合物用得最多,一般认为其抗菌机理分为两种,一种为Ag+直接破坏细菌的细胞膜或细胞原生质活性酶的活性,表现抗菌作用;另一种为在光照条件下,抗菌剂和水或空气作用,生成具有很强的氧化还原能力的活性氧O2,后者破坏细菌含琉基酶系统,发挥抗菌作用。抗菌制品形态不同,将会影响到活性成分Ag+的释放或活性氧的产生,进而影响到抗菌能力。另外,考虑到检样的物态、密度以及抗菌有效成分在样品中的分布等还会影响到抗菌成分与目标菌的接触机会,从而影响抑菌效果,故检样制备应区别对待。2.2h作用280%的抑菌率考虑到抗菌制品与目标菌的作用时间不同可能会影响到抑菌效果,将上述制品中的部分样品进行了不同反应时间的抑菌效果观察,可见丙纶纤维等4种抗菌制品在接触大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1小时后其抑菌率均在60%~80%之间,作用2小时后则抑菌率可上升到90%~99%,此后抑菌率则不再随着作用时间的延长而明显增加。结果表明,当作用时间为1h(消毒制品抑菌效果检测方法)时,抑菌率仅能达到60%~80%,如延长作用时间到24h,则虽能有限度地提高抑菌率,但却大大增加了实验时间,同时也为实验的质量控制增加了难度。而选择2小时作为抗菌制品抑菌效果检测之反应时间(既作用时间),相比既能达到客观评价抗菌制品的抗菌功能的目的,又能节省大量时间。Sakaguchi等亦认为含银或铜的抗菌制品在与目标菌接触20min~3h,菌落形成单位(CFU)显著减少。2.3抑菌率与表面积的关系可见,随着样品表面积的增加,电话机壳等4种抗菌制品的抑菌率亦相应增加,当样品表面积为20cm2时,抑菌率在30%~40%之间,表面积为50cm2时,抑菌率增加到60%~70%,而当表面积增加到100cm2时,金黄色葡萄球菌抑菌率达到了90%以上,大肠杆菌抑菌率在80%以上。当非溶出性抗菌制品密度较大