基于超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱的蛇胆陈皮口服液抗炎平喘活性成分快速检测

基于超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱的蛇胆陈皮口服液抗炎平喘活性成分快速检测

近年来，哮喘的发病率和死亡率有上升趋势。世界上约有3亿哮喘患者已成为最严重的慢性肺部疾病1%。哮喘通常与特应性变态反应有关,由慢性炎症引起,并导致气道高反应性增加,喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽的反复发作［2］。目前β2肾上腺素受体激动剂(β2-adrenergicreceptor,β2-AR)和NF-κB通路炎症抑制类药物是公认的治疗哮喘的一线药物,其作用机制也相对比较清晰［3］。临床研究发现,β2-AR与NF-κB抑制剂合用可明显减轻支气管哮喘与炎症的病理症状,为治疗支气管哮喘最有效的联合用药的模式［4-5］。根据中医辨证治疗原则,中成药蛇胆陈皮口服液临床上广泛用于治疗痰热雍盛所致支气管哮喘及慢性支气管炎［6］。复方中药药效成分复杂且机制不清一直是困扰中药现代化及国际化的主要瓶颈之一,阐明中药的有效成分及作用机制是解决问题的关键。鉴于中药在有效成分筛选和药效评价上的复杂性及关联性,将现代分析技术与现代细胞生物学评价相结合的谱效捕获技术是“中药谱效学”发展的主要手段［7-8］。本课题组将UPLC/Q-TOF-MS超强的分离能力及高分辨质谱的结构解析能力与双荧光报告基因高灵敏度且稳定的活性评价能力结合起来,建立了一种快速简便、灵敏度高、特异性强且可靠的筛选β2-AR与NF-κB抑制剂的分析方法,只需要通过极其微量的色谱分离即可快速筛选鉴定出复方中药中的平喘抗炎活性成分,为复方中药及复杂天然产物中平喘抗炎活性物质的研究提供了一种新的分析方法。1仪器、试剂和试药WatersAcquityTM超高效液相色谱系统,配置高真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Masslynx色谱工作站(Waters公司,USA);WatersQ-TOFPremier质谱仪(WatersMSTechnologies,Man-chester,UK);AcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)色谱柱(Waters公司,USA);Milli-Q超纯水仪(Millipore公司,USA);Modulus荧光检测仪(TurnerDesigns,USA);酶标仪(Bio-Rad公司,USA);CO2培养箱(Thermo公司,USA)。蛇胆陈皮口服液(江西济民可信药业有限公司);胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸(纯度大于98%,天津一方科技有限公司);双抗(氨苄青霉、链霉素100×)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM/HIGHGLUCOSE培养基(Gibco公司,USA);二甲基亚砜(DMSO)、转染试剂PEI、选择性抗生素Zeocin(Invitrogen公司,USA);双荧光素酶报告基因试剂盒、质粒pGL4.29、质粒pGL4.32、质粒Renilla(Promega公司,USA);地塞米松、亮氨酸-脑啡肽乙酸盐(LEA)(Sigma公司,USA);人源TNF-α(PeproTech公司,USA);乙腈为色谱纯。1.2体外膜转染及活性验证1.2.1UPLC-Q/TOF样品制备取蛇胆陈皮口服液100μL,过0.22μm微孔滤膜,进行UPLC-Q/TOF分析。1.2.2细胞培养过量表达β2AR的人肾胚细胞(humanembryonickidney293,HEK293)β2AR-293细胞株由本实验室构建并保存。β2AR-293细胞置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中用DMEM完全培养基培养(含有10%FBS和1%双抗);选用人支气管上皮细胞系BEAS-2B,置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中用DMEM/F12完全培养基培养(含有10%FBS和1%双抗)。1.2.3双荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染β2AR-293细胞培养于96孔板,待细胞融合至50%~70%时,用转染试剂PEI将β2AR荧光素酶报告基因质粒pGL4.29和内参荧光素酶报告基因质粒Re-nilla共转染入细胞内,分别加入pGL4.29100ng·孔－1和Renilla16ng·孔－1,转染试剂PEI(1mg·mL－1)与pGL4.29的比例为8∶1,转染24h后可用于后续实验。BEAS-2B细胞共转染方法相同,区别在于将NF-κB荧光素酶报告基因质粒pGL4.32和内参荧光素酶报告基因质粒Renilla共转染入细胞内,分别加入pGL4.32100ng·孔－1和Renilla9.6ng·孔－1。有效单体活性验证:设置空白对照组(Con)、模型组(Mod)、阳性药地塞米松组(Dex,1×10－6mol·L－1)、蛇胆陈皮口服液组(SDCP,1×10－4mol·L－1)、胆酸组(cholicacid,1×10－4mol·L－1)、牛磺鹅去氧胆酸组(taurochenodeoxycholicacid,1×10－4mol·L－1)、甘氨胆酸组(glycocholicacid,1×10－4mol·L－1)和牛磺胆酸组(taurocholicacid,1×10－4mol·L－1)共8组(n=6)。各组药物预孵育细胞1h后,加入TNF-α5ng·mL－1造模6h,收集细胞裂解液、细胞上清液用于NF-κB荧光活性及IL-6、IL-8等炎症因子的检测。给药结束后,收集各组细胞上清液,10000r·min－1,4℃离心10min后取上清,用ELISA法检测IL-6和IL-8的含量变化。1.2.6UPLC条件采用色谱柱WatersAcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm);流速0.4mL·min－1;PDA检测190~400nm扫描;进样量:1.0μL;柱温30℃;流动相:A为水,B为乙腈;二元梯度洗脱程序见表1。1.2.7质谱条件离子源为电喷雾离子源(ESI-MS),数据采集工作站为MassLynx4.1。正离子模式:离子源温度110℃;毛细管电压3.0kV;样品cone电压30V;雾化气为高纯氮气,雾化气流速600L·h－1,温度350℃;扫描范围50~1200,扫描频率0.1s,扫描间隔延时0.02s;校正液采用亮氨酸脑啡肽(LEA,[M+H]+=555.2931)。负离子模式:离子源温度110℃;毛细管电压2.5kV;样品cone电压45V;雾化气为高纯氮气,雾化气流速600L·h－1,温度350℃;扫描范围50~1200,扫描频率0.1s,扫描间隔延时0.02s;校正液采用亮氨酸脑啡肽(LEA,[M-H]－=553.2775)。2结果2.1-ar激活效应和nf-b抑制作用检测取蛇胆陈皮口服液100μL,用DMEM基础培养液等比稀释30、100、300、1000、3000和10000倍,通过建立的双荧光素酶报告体系进行β2-AR激活效应和NF-κB抑制作用的检测。结果提示,高浓度组蛇胆陈皮口服液具有明显β2-AR激活效应和显著的NF-κB活性抑制作用(图1),故我们进一步对蛇胆陈皮口服液进行UPLC/Q-TOF-MS分析及活性检测。2.2蛇胆陈皮口服液的uplc--1和2e-b双荧光检测蛇胆陈皮口服液经UPLC分离后,通过分流器分流,90%洗脱液收集于深孔板中用于活性检测,其余10%用于Q-TOF-MS分析,其正离子模式及负离子模式总离子流图见图2。按0.25min·孔－1收集蛇胆陈皮口服液的UPLC流出液,共收集88段,通过β2-AR和NF-κB双荧光检测系统检测每份流出液对β2-AR激活作用和NF-κB抑制作用活性,结果见图2D和2E,质谱信息见表2,其中11号峰辛弗林对β2-AR激活效应明显;胆酸(6号峰),甘氨胆酸(9号峰),牛磺鹅去氧胆酸(10号峰)和牛磺胆酸(13号峰)对抑制NF-κB激活作用效应明显,牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸对抑制NF-κB激活作用最显著。2.3林分平滑机制由于筛选的β2-AR激动剂为辛弗林,在前期的药理研究中已对辛弗林的平喘机制进行探讨。在抗炎成分评价中,蛇胆陈皮口服液筛选出的胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸等NF-κB抑制剂对炎症因子IL-6和IL-8表达的影响(图3),进一步验证其抗炎效果。3蛇胆陈皮口服液在本实验中,我们从蛇胆陈皮口服液中筛选鉴定出1个平喘成分辛弗林,辛弗林是一个众所周知的β2-AR激动剂,能扩张支气管平滑肌和血管骨骼肌,已被用于哮喘及鼻充血堵塞的治疗,可认为是蛇胆陈皮口服液中最主要的缓解支气管痉挛的成分［9］。在今后的实验可对方中协同辛弗林增效的成分进行筛选。3.2色谱柱及色谱柱的选择液相条件对色谱柱(AcquityBEHC18100或50mm)及流动相(甲醇-水或乙腈-水)进行了考察,100mm的长柱比短柱有更大的载样量且峰的分离能力更强,流动相选用乙腈有更平稳的基线、更好的峰形及信号响应,所以选取色谱柱为BEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)、流动相为乙腈-水,能更好地表征蛇胆陈皮口服液中主要的色谱峰(图2);然后对毛细管电压、离子源温度、锥孔气流量等质谱条件进行优化,最后确定锥孔气流量为50L·h－1,离子源温度为110℃,毛细管电压正离子模式下为3.0kV,负离子模式下为2.5kV。3.3细胞产品集中连接共转染前的细胞汇合度是影响转染效率的重要因素。当转染前细胞汇合度>80%共转染效率很低,细胞汇合度>90%时几乎无法进行共转染,经过双荧光报告基因检测系统测得的数值非常低,误差增大,结果无意义。故共转染前需要留意细胞汇合度,使汇合度控制在50%~70%时进行共转染较好。1.1细胞活力检测1.2.4UPLC分段样品的制备及活性检测蛇胆陈皮口服液经UPLC分离后,流出液用分流器按1∶9体积比进行分流,10%直接进入质谱用于物质结构信息分析;其余90%收集于深孔板(规格为孔容积2.2mL)中用于NF-κB和β2-AR荧光活性检测,流出液每隔0.25min收集为1段,收集后置于真空干燥箱中,40℃挥干流动相,残留物直接加入细胞培养基(100μL·孔-1