漆酶活化处理木材纤维胶合作用的研究

漆酶活化处理木材纤维胶合作用的研究

油漆是氧化还原酶，它可以催化许多有机化合物和少量有机物的反应，产生分解木材，并与有毒酚类物质一起作用，以消除苯氧基类杂草和肉碱水域的毒性。近年来，它在造纸、饮料加工和环境保护等方面取得了广泛的研究和应用（yaroprovo等人，1994）。其中，可以使用油漆激活处理，使木材中的木质素激活并产生结合作用，如粘土纤维或树柄。用于制造人造板、挤丝和制造人造板。国外对漆酶活化处理木材已经进行了较多的研究,并取得了一定进展(曹永建等,2005)。Febly等(1997)用漆酶氧化山毛榉(Faguslongipetiolata)木纤维,室温下加入3μg酶蛋白·g-1纤维,酶处理1h,干燥后,200℃热压成3mm的纤维板,其抗弯强度(MOR)为40.3MPa,而抗弯弹性模量(MOE)为4.10MPa,尺寸稳定性极好;Viikari(1998)用漆酶处理木纤维生产的纤维板,内结合强度超过0.9MPa,拉伸强度提高了38MPa;朱家琪等(2004)用湿法纤维板生产工艺,对漆酶处理木纤维生产纤维板进行试验研究,结果表明:用漆酶处理木材纤维,可以赋予木材自身胶合力,纤维板的内胶合强度(IB)超过1.0MPa。漆酶处理木材纤维并产生胶合作用,主要是因为酶活化产生的自由基起作用,但对漆酶活化木材产生的自由基种类、木材自由基的变化影响及其胶合机理都缺乏研究。本文采用漆酶活化处理木材,利用电子自旋共振(electronspinresonance,ESR)波谱仪测定漆酶处理前后木材自由基的种类及其变化,探讨漆酶处理条件对木材自由基形成变化的影响,为揭示漆酶活化处理木材产生胶合作用机理提供依据。1材料和方法1.1制备边材和心材木粉模型木材试样为枫香(Liquidambarformosana)、思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)边材和心材木粉(60~80目),漆酶为中国科学院微生物研究所制备(酶活19U·mL-1)。分析用试剂有:醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH值为3.47和6.50)、自旋捕捉剂N叔丁基-α-苯基硝酮(PBN,N-tert-butyl-α-phenylnitrone)(Sigma公司产品)、乙酸乙酯等。1.2电子自旋共振波谱法检测木粉ph值选用枫香、思茅松边材和心材3种木材试样,采用仅加去离子水作为对照以及漆酶处理进行试验。各试样处理步骤如下:对照,取各种木粉45mg放入不同离心管中,分别加入去离子水450μL、自旋捕捉剂PBN溶液50μL、0.04mol·L-1(终浓度为2.2mmol·L-1);漆酶处理,取各种木粉45mg放入不同离心管中,分别加入漆酶液450μL、2种pH值(3.47、6.50)缓冲液450μL和自旋捕捉剂PBN溶液50μL、0.04mol·L-1(终浓度为2.2mmol·L-1)。将添加了各种处理试剂的离心管放入水浴锅中,32℃下反应2h后,取出迅速放入碎冰中,再分别加入300μL乙酸乙酯到各离心管中用于萃取,振动100~120s,使之充分混匀,然后离心4min(9000r·min-1),使离心管中的悬浮液分层,用微量进样器吸取上层清液,并立即进行ESR测定。电子自旋共振波谱仪为德国产BrukerER200D-SRC,X-band。测试条件为:中心磁场,3385G;扫描宽度,400G;调制幅度,3.2G;增益,400000;微波功率,20mW。每个试样进行3个重复的测定,以3个重复的平均值作为该样品的平均值。自由基的相对浓度计算方法是测量ESR图谱中的峰高,以其平均值作为该样品的自由基浓度。1.3数据分析2结果与分析2.1发酵剂和微胶囊的esr检测活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)自由基是一大类自由基的总称,反应活性大、氧化能力强,包括超氧阴离子自由基、超氧自由基O2·、羟基自由基·OH、单线态氧O12、脂类自由基等,由于其活性大,在极性水相条件下,不易检测。为此,本研究采用Cao等(2005)得到的ROS自由基检测方法,采用自旋捕捉剂PBN进行捕捉,并用乙酸乙酯萃取后检测,该方法可以将寿命较短的ROS自由基较长时间保存并检测,克服了以往ROS自由基检测的难题。从图1可见,未处理枫香木材的ESR图谱为典型的无超精细分裂的粉状图谱,与Felby等(1997)得到的木纤维ESR谱图相同。其g值为2.0038,与酚氧自由基的g值相同;根据Capani等(2001)的研究结果,一般活性氧类自由基ESR谱图为3到6线峰。从图2漆酶活化处理枫香木材的自由基谱图可见,与图1明显不同,属于典型的活性氧类自由基ESR谱图,其g值为2.005,aN=15.0G。2.2ros自由基浓度如图3所示,与对照(16.87±1.69)mm相比,pH3.47的漆酶处理后,枫香木材ROS自由基浓度[(33.23±4.8)mm,P<0.01]升高了97%;pH6.50的漆酶处理后,ROS自由基的浓度[(23.03±4.93)mm,P=0.11]升高了36.6%,表明pH3.47时漆酶处理效果比pH6.50时的好。单因素方差分析表明,pH值对漆酶处理枫香木材产生自由基的浓度差异极显著(P<0.01,图3)。2.3ph值对漆酶活性体系活性的影响如图3所示,与对照组(62.7±15.62)mm相比,经pH3.47的漆酶处理后思茅松边材悬浮液中ROS自由基的浓度[(138±12.29)mm,P<0.01]升高了120%;经pH6.50的漆酶处理后ROS自由基的浓度[(70.9±7.82)mm,P=0.46]升高了13%,表明pH3.47时漆酶处理效果比pH6.50时的好。单因素方差分析表明,pH值对漆酶处理思茅松边材ROS自由基的浓度差异极显著(P<0.01,图3)。同理可得出,与对照组(53.43±4.5)mm相比,pH3.47的漆酶处理后思茅松心材ROS自由基的浓度[(135.67±15.8)mm,P<0.01]升高了154%;pH6.50的漆酶处理后ROS自由基的浓度[(64.2±3.55)mm,P<0.05]升高了20%,表明pH3.47时漆酶处理效果比pH6.50时的好。单因素方差分析表明,pH值对漆酶处理思茅松心材产生ROS自由基浓度差异极显著(P<0.01,图3)。pH值大小对漆酶活化木材自由基浓度影响显著,其原因与酶催化处理的条件和酶活性高低有关,酶活过低或过高都有可能抑制木材活性氧自由基的产生,从而降低酶的催化氧化效率。漆酶在较低的pH值下,其活化效率最佳。因此,pH3.47比pH6.50条件下,活化木材的ROS自由基浓度高。2.4漆酶处理与木材ros自由基的关系如图4所示,思茅松边材ROS自由基的浓度最大,思茅松心材的次之,而枫香木材的最小。单因素方差分析表明,不同树种木材ROS自由基浓度差异极显著(P<0.01,图4)。这说明漆酶处理产生ROS自由基与树种密切相关,思茅松边、心材漆酶处理效果优于枫香木材,而漆酶处理对思茅松心、边材产生ROS自由基的大小没有显著性影响。漆酶活化木材能产生木材ROS自由基,其活化实质是激活木材中木质素上的自由基。思茅松边材及心材、枫香木材漆酶活化处理后不同树种间有显著差异,这主要与木材中的木质素含量大小密切相关,木材化学组分分析表明,思茅松边材及心材的木质素含量比枫香木材明显要高,思茅松木质素含量为28.55%,而枫香的木质素含量为24.25%(李坚,1998)。3漆酶处理效果及影响因素分析1)未处理木材的自由基为酚氧自由基,而漆酶处理木材产生了活性氧类(ROS)自由基。2)漆酶处理3种木材均能产生ROS自由基,且pH3.