细胞克隆形成实验及细胞免疫组化

细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验

(a)

平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞

(b)

软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：

(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5%CO2温箱中培养10～14天。

(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)

将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml上层琼脂和100ul单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2－3周，计数含50个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII采集图像。注意事项1.接种时细胞密度适度，不可过高。2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装；4.细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响；5.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。6.细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1.细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色定。2.PBS清洗标本3次各1min。3.冰丙酮固定15min(或4%多聚甲醛固定30min)。4.空气干燥5min。5.PBS清洗标本3次各2min。6.0.5%TritonX-100(DPBS配)孵育1次20min。7.PBS清洗标本3次各2min。8.3%H2O2（试剂A）孵育15min。9.DPBS清洗标本3次各2min。10.封闭血清孵育（试剂B）20min。11.一抗孵育（滴度1：200，湿盒）4℃过夜或37℃60min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液12.PBS清洗标本3次各5min。13.二抗工作液孵育（湿盒试剂C）37℃30min。14.PBS清洗标本3次各5min。15.试剂D（湿盒）37℃30min。16、PBS清洗标本3次各5min。17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。18、蒸馏水洗2次1min。19、苏木素复染0.5~1min。20、自来水洗返蓝。21.梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。22.二甲苯透明2次3min。23、中性树胶封片。注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、TritonX-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24孔，或6孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，到固定时细胞生长到80％左右比较合适。偶是在盖玻片上做的，首先细胞要爬的匀一些，象dongwp战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。细胞爬片的保存和抗原修复问题总结1.细胞爬片可以用含叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!!加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04--0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!2.louischenwrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?!应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20度保存4.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。5.丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会6.丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备用。7.(1)细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟(2)4%多聚甲醛固定，室温，20分钟(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好8.我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好9.细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。10.细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用PBS冲洗，在做以后的步鄹11.我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，有的差一些。最好避光保存在4度，同时尽量隔绝空气。免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。12.细胞爬片丙酮固定后-20度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了13.爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能是：1)试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2)加一抗前处理同石蜡切片，可进行抗原修复，如胰酶消化或热修复。3)因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。如不能解决你的问题请QQ联系：81825645。本人在湖南省肿瘤医院病理科(长沙市)做免疫组化。14.4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20度，2-3个月是没有问题的。15.对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，—-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。如：1.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等2.乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度3.甲醛(福尔马林)应用最广优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。16.4度是不能保存这么长时间(1个月)的，如果抗原已被分解，再修复也没用!17.弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。18.爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。19.固定后放点PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。20.固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。21.四度放1周应该没问题的，你最好放在-20度，我在-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题.22.最佳的固定及保存方法：(1)中性缓冲福尔马林(不必调pH)：福尔马林(40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和)10.0mlNa2HPO4.12H2o1.9653gNaH2PO4.2H2O0.5460g加0.85%NaCl溶液溶解，定容至100ml。(2)细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖玻片，迅速于37℃PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。(3)将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。(4)用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20℃备用。可长期保存，做实验时，取出片子，入PBS湿润后即可进行你的实验。可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。(本帖没有加分)23.细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可以用.24.skywalkerzzwrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片?爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片25.本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。26.细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。27.1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15min，PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了2、爬片PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否能保存，怎样保存?1、洗过就可以做免疫组化了。2、固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。做之前再洗。28.细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。29.如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,30.适当密度后取出固定(丙酮-20固定10～20min)，再进行免疫染色。31.一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。32.细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。33.4%多聚甲醛固定后PBS水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1月。34.如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞。35.可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Thermanox™Coverslips。高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪，使用效果好。上海生工有现货，不用国外定货。我使用后，觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。36.我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水(80%，90%，100%，100%酒精各一次，每次10分钟左右)，然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是可以的。免疫细胞化学染色操作规程一、材料和1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。4、0.01MPH7.4PBS5、1%BSA-PBS（含0.05%Tween20）6、AEC底物（1）底物缓冲液（20X）PH4.6醋酸（分子量60.6）30.6mlTriton-100醋酸钠3H2O（分子量136.1）66.68克加蒸馏水到960ml，调PH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml（2）AEC（20X）AEC15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2分子量73.10中）（3）0.6%H2O2（20X）临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。7、DAB（即DAB-4HCL）（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）（2）1MTris（20X），用HCL调PH到7.4（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。溶解后（可加热到500C），加水合氯醛50克（水合氯醛ChloralHyclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或40C保存。8、苏木素复染液苏木素1克碘酸钠0.2克钾矾50克水1000ml9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。10、3%H2O2：30%H2O21份，加9份双蒸水，临用时配。11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板（见ICCprotocol04）12、封片液：1克明胶，溶于30ml350C水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或370C10-15分钟，使恢复温度。2、加3%H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分覆盖住细胞。3、室温10分钟后，甩掉H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。三、封闭细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分钟后甩掉封闭液，不洗。四、免疫化学染色1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。37℃1小时或4℃冰箱过夜；2、弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4次；3、加S.P（S.P法，即放大法）（1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。37℃温和孵育30分钟；（2）按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干；（3）加已优选好浓度的S.P，用量同“（1）”，37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干；4、间接法加二抗（不放大法）方法同S.P法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。并省略（3）步骤；5、加底物显色（1）、加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，板50ul/孔，置于37℃恒温箱孵育5-10分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为“+++”），用自来水即可终止反应；（2）、复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝色，最后在蒸馏水中漂洗。6、封片洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油—明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。五、结果判断KSHV阳性——诱导后BCBL-1细胞有10%-30%显红色，强度不一，未诱导BCBL-1阳性细胞（1-30%）阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色（排除边缘效应）MCMV/HVMV阳性——感染病毒的细胞有病灶反应，显红色，强度不一，未感染细胞不