qRT-PCR多媒体教学课件

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)

qRT-PCR提纲：

实时荧光定量PCR原理

数学原理化学原理实时荧光定量PCR的方法应用绝对定量相对定量定量PCR的实验要素平台定量PCR仪器介绍qRT-PCR实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。qRT-PCR

与普通PCR的区别

普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。qRT-PCRqRT-PCRqRT-PCRqRT-PCR荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。qRT-PCRqRT-PCR

定量PCR的数学原理

qRT-PCRqRT-PCR

斜率与扩增效率qRT-PCRqRT-PCR

荧光定量PCR化学原理

非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen

特异性荧光标记：

2、TaqManqRT-PCR1、SYBRGreen法qRT-PCRSYBRGreen熔解曲线分析

qRT-PCRSYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA

使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜qRT-PCR2、TaqMan探针法

qRT-PCRTaqMan作用机理

qRT-PCR

TaqMan法优缺点

qRT-PCRReal-timePCR方法应用qRT-PCR•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原体检测转基因食品检测基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究qRT-PCR

绝对定量与相对定量的定义

qRT-PCR绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：•含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒•含有和待测样品相同扩增片段的cDNA•PCR的产物qRT-PCR绝对定量：从荧光到拷贝数

qRT-PCR

相对定量通过内标定量

内标（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量qRT-PCR

相对定量：参照因子Calibrator

qRT-PCR

相对定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内

1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：

2–ΔΔCT=表达量的比值qRT-PCR

相对定量分析方法2：双标准曲线法

目标基因与内参基因扩增效率不同

待测样品目的基因浓度

待测样品内参基因浓度

F=

对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度qRT-PCR

定量PCR的实验要素qRT-PCR

样品

●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之间●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA纯度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1uLqRT-PCR

标准品

qRT-PCR

标准品梯度稀释方法

qRT-PCR复管测试●样品和标准品都要重复●重复次数须遵循统计学要求qRT-PCR平台PCR仪介绍ABI7500fast特征：使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）Rn=Normalization=Reporter/ReferencqRT-PCRRotorgene6500HRM特征