大果沙棘黄酮对四氧啶诱导糖尿病小鼠血糖水平的影响

大果沙棘黄酮对四氧啶诱导糖尿病小鼠血糖水平的影响

糖尿病患者对胰岛素的分泌能力和身体对胰岛素的敏感性逐渐降低，血糖增加是糖尿病的主要原因。摄入高热量及高脂肪、高蛋白等结构不合理饮食会导致肥胖,随着体重的增加及缺乏运动,胰岛素抵抗会进行性加重,也会导致胰岛素分泌缺陷和Ⅱ型糖尿病及其并发症的发生。糖尿病并发症是一种常见的慢性并发症,是由糖尿病病变转变而来,会引起一系列常见糖尿病并发疾病症状如:肾功能衰竭、失明、脑血管病变、心脏病等,甚至危及生命。但目前降血糖的化学药品由于其毒副作用大,不宜长期服用,并且常伴随不适症状发生。所以开发自然资源,研究中医药治疗和改善血糖变化,预防糖尿病并发症的发生有十分重要的临床意义。目前,已有研究表明,黄酮类化合物对ALX诱导的糖尿病动物血糖、血脂具一定的降低作用,对糖尿病和高血脂并发症的治疗有一定功效。且现研究报道中发现大果沙棘(Hippophaerhamnoidesvar.sp)果中含有大量的生物活性物质,包括黄酮、多酚、类胡萝卜素、有机酸、脂类等,其主要活性成分为沙棘黄酮,此活性因子使其具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、保肝、抑菌、保护心血管系统等生理功能,且具有很好的预防治疗糖尿病及其并发症的功效。为了深入探讨黄酮类化合物对糖尿病小鼠血糖的影响情况,本研究选择大果沙棘为研究对象,用四氧嘧啶(Alloxan,ALX)诱导建立糖尿病小鼠模型,研究大果沙棘总黄酮及各流份段黄酮对ALX糖尿病鼠血糖的对比影响,通过灌胃小鼠大果沙棘总黄酮BFH及各流段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ与模型组作比较,研究大果沙棘不同组分黄酮对机体血糖影响情况,以期为揭示大果沙棘黄酮的降血糖作用提供参考。1材料和方法1.1试剂与仪器大果沙棘果渣由黑龙江省孙吴县林业局提供;四氧嘧啶(ALX)Sigma公司;麦芽糖酶(CAT)试剂盒、尿素氮(BUN)试剂盒、肝(肌)糖元(glycogen)试剂盒、胰岛素(insulin)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供;昆明小鼠清洁级,雄性,体质量(25±2.0)g,由黑龙江省肿瘤医院提供,小鼠预先分笼饲养,室温(22±1.0)℃,相对湿度60%±5.0%。722s可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;NDJ-1电热恒温水浴锅北京医疗电子仪器厂;R-205B旋转蒸发仪上海申胜仪器公司;FJ-200高速万能粉碎机天津泰斯特仪器公司;TDL-5台式离心机上海科兴仪器有限公司;WI305227血糖仪北京东仪科技有限公司;Model550酶标仪美国Bio-Rad公司。1.2大果沙棘总黄酮的制备1.2.1大果沙棘果渣黄酮提取纯化室将大果沙棘果渣于40℃下烘干,粉碎过40目筛。称取相应质量的大果沙棘果渣利用超临界CO2萃取系统将其进行脱脂处理,再用70%乙醇进行提取。充分搅拌后,采用超声功率120W超声辅助提取3次,每次超声时间1h,每隔30min振荡一次,将提取得到的黄酮浸提液经离心、过滤、浓缩、冷冻干燥,得到大果沙棘黄酮粗提物即SBPF。将SBPF粗提取物采用型号为X-5大孔树脂动态吸附层析,吸附达到饱和后用70%乙醇溶液洗脱处理,再经浓缩、冻干处理后得到实验所需的大果沙棘总黄酮(BFH)。经过上述一系列实验处理后,再进行二次洗脱操作处理收集洗脱液,经紫外扫描,将扫描峰形一致的洗脱液合并收集,得到大果沙棘黄酮三段流份,分别为BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ。1.2.2ALX诱导糖尿病小鼠模型的建立将小鼠先放入动物室内适应性喂基础饲料观察7d,禁食12h,自由饮水。用灭菌生理盐水配制2%ALX溶液,每只小鼠选用100mg/kg·bw剂量一次性腹腔注射ALX制作糖尿病小鼠模型。注射72h后,尾静脉采血,测定禁食12h后空腹血糖值,选取空腹血糖值大于11.10mmol/L的小鼠为模型小鼠。1.2.3动物分组与处理选取体重(25±2)g的小鼠200只,按沙棘黄酮流份不同将小鼠平均分为四大组,每大组平均分为五小组,即基础对照组、模型对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每小组10只小鼠。低、中、三个剂量组是按沙棘黄酮人体推荐摄入量、人体推荐摄入量的10、20倍分为低(2.0g/kg·bw)、中(20g/kg·bw)、高(40g/kg·bw)剂量组。小鼠糖尿病模型成功建立后,开始灌胃沙棘总黄酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ组分,灌胃剂量分别为2.0、20、40mg/(kg·bw·d)。给药组每天灌胃给药一次,正常小鼠对照组和模型组每天灌胃等体积生理盐水,连续4周。每天测体重一次。每周测血糖一次,并根据体质量调整灌胃量,灌胃期间小鼠自由取食和饮水。灌胃4周后,禁食12h,眼球采血、常规操作分离血清,再分别测定Insulin、BUN含量及麦芽糖酶活力;解剖取肝脏和肌肉制成组织匀浆,分别测定肝(肌)糖元含量。1.2.4指标的测定以上测定指标均严格按照试剂盒说明书进行操作。2结果与分析2.1降血糖功能检测结果实验进行总黄酮及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组灌胃4周后对ALX糖尿病小鼠血糖的影响对比研究。总黄酮BFH及各流份段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量对ALX糖尿病小鼠血糖的影响结果,见图1。图1结果显示,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组小鼠的血糖测量值都极显著(p<0.01)低于模型组,且各剂量组之间降血糖功能差异显著,BFH各剂量组降血糖功能要略优于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组,并呈一定的量效关系。从图1中可以看出,BFHⅢ各剂量组与模型组相比,均极显著降低(p<0.01)。但BFH、BFHⅠ、及BFHⅡ高剂量组的血糖值比模型组均显著(p>0.05)降低,且分别降低了58.35%、54.01%及52.73%。BFHⅢ高剂量组与模型组血糖值比较降低了36.95%,作用效果较BFH、BFHⅠ及BFHⅡ高剂量组略差。以上结果表明,在一定范围内,BFH、BFHⅠ及BFHⅢ各灌胃组随剂量的增加,血糖值变化呈下降趋势,BFHⅡ剂量组变化不显著(p>0.05),即对血糖调节作用效果越好,表明大果沙棘黄酮对糖尿病小鼠具有一定的血糖调节功能。2.2对小鼠中inin测量的影响实验进行总黄酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组灌胃4周后对ALX糖尿病小鼠Insulin的影响对比研究。总黄酮BFH及各流份段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量对ALX糖尿病小鼠Insulin的影响结果,见图2。图2结果显示,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组小鼠的Insulin测量值都极显著(p<0.01)高于模型组,且各剂量组之间对Insulin的调节作用存在差异性。在一定剂量范围内,随着,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量灌胃剂量的增加,调节能力增强,且增加的幅度不明显。即BFH各剂量组调节Insulin水平的能力要低于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组,并呈一定的量效关系。从图2中可以看出,以高剂量组为例,BFH比模型组升高了63.15%,BFHⅠ比模型组升高了50.27%,BFHⅡ比模型组升高了47.78%,BFHⅢ比模型组升高了70.96%。表明大果沙棘黄酮各剂量组对糖尿病小鼠的Insulin水平具有一定的调节功能。2.3灌胃对bun的影响实验进行总黄酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组灌胃4周后对ALX糖尿病小鼠BUN的影响对比研究。总黄酮BFH及各流份段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量对ALX糖尿病小鼠BUN的影响结果,见图3。图3结果显示,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组小鼠的BUN测量值都显著(p<0.01)低于模型组,除BFHⅢ各剂量组之间调节BUN能力的变化趋势降不明显外,其他BFH和BFHⅠ、BFHⅡ各组均随着灌胃剂量的增加,BUN调节能力有所增强。从图3中可以看出,BFH低剂量组与BFHⅠ、BFHⅢ低剂量组对BUN调节水平的能力几乎相同,而BFHⅡ中、高剂量组却优于BFHⅠ、BFHⅢ中、高剂量组,BFHⅡ各剂量组是BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组中作用效果最显著的,且BFHⅡ中、高剂量组是与模型组比较分别降低了31.97%,42.15%。且BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各组中模型组小鼠的BUN与模型对照组小鼠的BUN存在显著(p<0.05)差异,说明小鼠肾脏已经有一定的损伤。以上结果表明,在一定范围内,BFH、BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各灌胃组均对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠BUN有一定的调节作用,说明大果沙棘黄酮对肾脏损伤小鼠具有一定的修复作用。2.4酮bfh对alx小鼠麦芽糖酶的影响实验进行总黄酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组灌胃4周后对ALX糖尿病小鼠麦芽糖酶的影响对比研究。总黄酮BFH及各流份段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量对ALX糖尿病小鼠麦芽糖酶的影响结果,见图4。由图4可见,BFH与BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均可提高糖尿病小鼠的麦芽糖酶的水平,并且随着各组剂量的增加,调节能力增强,且BFH各剂量对糖尿病小鼠的麦芽糖酶的调节能力明显优于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ对应的各剂量组。以高剂量组为例,分别比模型组升高了37.69%、69.09%、72.36%、95.96%。2.5模型小鼠肝糖元和肌糖元的调节能力实验进行总黄酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组灌胃4周后对ALX糖尿病小鼠肝糖元的影响对比研究。总黄酮BFH及各流份段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量对ALX糖尿病小鼠肝糖元及肌糖元的影响结果,见图5。由图5可见,BFH与BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组,对ALX糖尿病小鼠的肝糖元和肌糖元均具有一定的调节作用,并且随着剂量的增加,调节能力增强,肝(肌)糖元的含量呈上升趋势。BFH对增强肝糖元的能力要优于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ。以高剂量组为例,分别比模型组提高了89.62%、73.68%、57.89%和35.08%。对肌糖元的调节能力以高剂量组为例,分别比模型组高1.17倍,1倍,73%和60%。BFH对增强肌糖元的能力要优于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ,这与对肌糖元的影响效果趋势是一致的。表明BFH与BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各剂量组对ALX诱导的糖尿病小鼠具有一定的改善作用。3大果沙棘总黄酮bfh对小鼠血糖的影响糖尿病主要由胰岛素分泌的绝对或相对缺乏所引起。ALX是一种特异性的胰岛B细胞毒剂,对胰岛B细胞具有细胞毒作用,导致胰岛素分泌不足而诱发糖尿病。并在体内可选择性被胰腺B细胞吸收,激活自由基链式反应产生过量的自由基。过量自由基能够直接破坏B细胞的结构,导致胰岛B细胞的损伤和坏死,胰岛素水平降低而出现高血糖等糖尿病症状。本实验通过四氧嘧啶诱导建立糖尿病小鼠模型,ALX诱导的糖尿病模型成功后,研究了大果沙棘总黄酮BFH及各流份段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ对糖尿病小鼠血糖的调节作用。结果表明,模型组小鼠血糖与正常组比较,血糖明显升高且稳定,表明ALX诱导的糖尿病模型具有一定的稳定性。综上,通过对相关测定指标血糖值、Insulin、BUN、麦芽糖酶及肝糖元和肌糖元的相关分析,实验验证了大果沙棘黄酮对ALX所致胰岛β细胞的损伤有一定的保护作用,BFH和各流份段黄酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均可以显著(p<0.05)提高ALX糖尿病小鼠的血清胰岛素水平,对肾功能损害也有一定的修复作用,表明大果沙棘黄酮对肾脏也具有一定的保护作用,对脂质代谢异常有一定的纠正修复功能,本研究结果与现有同类天然植物多酚研究如葛雷的苹果渣多酚及贾仁勇等