GB 4789.3-2016 大肠菌群计数 好

食品微生物学检验

大肠菌群计数

浙江工商大学赵广英GB4789.3-2016食品安全国家标准

食品微生物学检验大肠菌群计数

Nationalfoodsafetystandard

Foodmicrobiologicalexamination

Enumerationofcoliforms

2016-12-23发布2010-06-23实施中华人民共和国卫生部发布前言本标准代替GB4789.3—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。本标准与GB4789.3—2010相比,主要变化如下:——增加了检验原理;——修改了适用范围;——修改了典型菌落的形态描述;——修改了第二法平板菌落数的选择;——修改了第二法证实试验;——修改了第二法平板计数的报告1范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

大肠杆菌(e-coli)2术语和定义

2.1大肠菌群（coliforms）:在一定培养条件下（基质、在36±1℃48h－96h）能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞（中小）杆菌。

（一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。）（加）*用途：该菌主要来源于人和温血动物粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量；推断食品中有否污染肠道致病菌（如霍乱、伤寒、痢疾等）的可能。为何选用大肠菌群作为食物和饮水被粪便污染的指标－指示菌？

－－因其符合作为指示菌的条件：

①来源只有肠道，且普遍而量多：②在外界生存条件和肠道致病菌相符或略长，但不在水中繁殖;③对消毒药的抵抗力和肠道致病菌相符;④检查方法比较简单。还有什么菌可作为食物和饮水被粪便污染的指标菌？

－－产气荚膜杆菌和粪链球菌可辅助证明，二者都是重要肠道正常菌群成员产气荚膜杆菌：可在外界环境中形成芽胞，抵抗力强，存活时间长，对氯抵抗力强；检测有氯消毒水的污染情况。粪链球菌：在自然环境中存活时间又较短。大肠菌群、产气荚膜杆菌和粪链球菌三者都检出说明食品新近被粪便所污染。2.2

最可能数mostprobablenumber，MPN:最可能数mostprobablenumber，MPN:基于泊松分布的一种间接计数方法。（加）泊松分布(Poissondistribution):（述昆虫随机分布型的数学表达公式。）一种概率分布，其特点是该分布的均值等于方差。适合于描述单位时间内随机事件发生的次数。Siméon-DenisPoisson*在生态学中常用来描述随机分布型的生物个体的空间分布格局。泊松分布是一种统计与概率学里常见到的离散概率分布，由法国数学家西莫恩·德尼·泊松（Siméon-DenisPoisson）在1838年发表。3检验原理3.1MPN法

MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

3.2平板计数法

大肠菌群在固体培养基中（结晶紫中性红胆盐琼脂）发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃。······3.11菌落计数器

5培养基和试剂5.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。5.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。5.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。5.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。5.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。5.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。5.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。5.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1成分胰蛋白胨或胰酪胨

20.0g

氯化钠5.0g

乳糖

（产酸产气）

5.0g

磷酸氢二钾

2.75g

磷酸二氢钾2.75g

月桂基硫酸钠*0.1g

蒸馏水1000.0mL

pH6.8±0.2*月桂基硫酸钠（又称十二烷基硫酸钠/椰油醇（或月桂醇）硫酸钠）：抑制非大肠菌群的细菌生长和修复已损伤的大肠菌群细胞的作用制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调解pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。

大肠杆菌在月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)上典型特征

大肠菌群检验中常用的抑菌剂：大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、月桂基/十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。5.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。

成分蛋白胨10.0g

乳糖

10.0g产酸产气

牛胆粉溶液

200mL抑制G+菌

（oxgall或oxbile）

0.1%煌绿水溶液

13.3mL抑制非肠道杆菌蒸馏水800mL

pH7.2±0.1

大肠菌群在煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB）中生长制法

将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，PH7.0~7.5)用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.4，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。5.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。成分蛋白胨

7.0g

酵母膏3.0g

乳糖10.0g产酸产气氯化钠5.0g

胆盐或3号胆盐

1.5g抑制杂菌中性红0.03gpH6.8（红）－8.0（黄）

结晶紫

0.002g抑制杂菌，特别是G＋菌琼脂15~18g

蒸馏水1000.0mLpH7.4±0.1

大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上的典型特征

5.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。5.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。5.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。5.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。欢迎专家莅临指导！食品安全国家标准

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2016-12-23发布2010-06-23实施中华人民共和国卫生部发布第一法大肠菌群MPN计数法

6检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。初发酵试验；选择性增菌。月桂基硫酸盐胰蛋白胨3个×3管×1mL24h-适用于含目的菌量较少的样品；续图1复发酵试验；选择性更强。一环接种煌绿乳糖胆盐（见附录B）总耗时3-4d.7操作步骤

7.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。7.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。7.1.3

样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。7.1.4

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。7.1.5

根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。7.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。7.3复发酵试验：用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告：按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。附录B第二法大肠菌群平板计数法：8检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。2－3d大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂上的典型菌落煌绿乳糖胆盐肉汤选择性鉴别培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂；2个平皿*2-3稀释度*1mL=4-6个平皿证实试验：10个菌落接种10管肉汤9操作步骤9.1样品的稀释按6.1进行。9.2平板计数9.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。9.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。9.4证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。9.3平板菌落数的选择选取菌落数在15