GB 4789.14 -2014 蜡样芽胞杆菌 好

食品安全国家标准食品微生物学检验

蜡样芽胞杆菌检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:ExaminationofBacilluscereusGB4789.14-2014发布2014-12-012015-05-01实施第一部分基础知识1、概述2、生物学特性3、毒素与分型第二部分国标1、培养基和试剂2、检验程序3、说明www.uio.no/miljoforum/helse/farmas.shtml

分布:自然环境中广泛分布－－污染食品，多见于米饭、甜点心、乳制品、蔬菜、水果、干果和肉制品、汤汁和豆芽等。

----我国下夏秋季隔夜剩米饭中毒为主。

----芽孢耐热100度30min；繁殖温度嗜中温。－－当摄入的食品每克中蜡状芽孢杆菌的活菌数在106

/g食品以上可导致食物中毒暴发。

105/g食品为危险食品。－－以恶心、呕吐、腹疼、腹泻症状为主要症状。－－中毒可散在、家庭或群体大规模暴发。因此，检测食品中蜡状芽孢杆菌具有重要卫生学意义。

第一部分基础知识

概述第一部分蜡状芽孢杆菌概述1.分布广泛：本菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。2.主要引起中毒的食物：在美国和我国，在夏秋季以受污染的隔夜剩与（炒）米饭或淀粉类制品为主；

在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；

3.

芽孢耐热：繁本菌为嗜中温菌，芽孢耐热100度30min；污染的剩米饭温热保存，可致本菌大量繁殖；

4.

毒力：当摄入的食品每克中蜡状芽孢杆菌的活

菌数在106

/g食品以上可导致食物中

毒暴发。105/g

食品为危险食品。5.中毒：以恶心、呕吐、腹疼、腹泻症状为主要症状。中毒可散在、家庭或群体大规模暴发暴发。1）形态与染色

蜡状芽孢杆菌为有周身鞭毛的G+需氧芽孢大杆菌。

6、生物学特性2）培养特性

*在普通营养琼脂平板上：

生长成白蜡状的大R形菌落。

3）生化特性（在种间和种内型间分型用，见国标表1和表2）

*能分解麦芽糖、蔗糖和水杨苷；*厌氧条件下发酵葡萄糖。*不分解乳糖、甘露醇、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇；*硫化氢、尿素试验阴性，*卵磷脂酶试验阳性，能在24h内液化明胶，

β－溶血;

7、毒素和酶

在肉汤培养物中产生:*肠毒素:引起食物中毒的主要原因*溶血毒素*蛋白质分解酶*卵磷脂酶*青霉素酶等。第二部分GB

前言本标准代替GB/T4789.14-2003《食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》。本标准与GB/T4789.14-2003相比，主要变化如下：

—修改了标准的中文名称；

—增加了第二法蜡样芽胞杆菌MPN计数法；—将选择性分离培养基（MYP）培养条件由37℃培养12h～20h改为30℃±1℃培养24h～48h；—增加了溶菌酶试验；—修改了操作步骤；—增加了附录A、附录B1范围本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）的检验方法。本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数；第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。

2设备和材料略3培养基和试剂3.1磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录A中A.1。3.2甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂：见附录A中A.2。3.3胰酪胨大豆多黏菌素肉汤：见附录A中A.3。3.4营养琼脂：见附录A中A.4。3.5过氧化氢溶液：见附录A中A.5。3.6动力培养基：见附录A中A.6。3.7硝酸盐肉汤：见附录A中A.7。3.8酪蛋白琼脂：见附录A中A.8。3.9硫酸锰营养琼脂培养基：见附录A中A.9。3.100.5%碱性复红：见附录A中A.10。3.11动力培养基：见附录A中A.11。3.12糖发酵管：见附录A中A.12。3.13V-P培养基：见附录A中A.13。3.14胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂：见附录A中A.14。3.15溶菌酶营养肉汤：见附录A中A.15。

3.16西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.16。3.17明胶培养基：见附录A中A.17。3培养基和试剂3.1磷酸盐缓冲液（PBS）：略3.2甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂：见附录A中A.2。选择性鉴别培养基D－甘露醇：（发酵产酸：－）；酚红指示范围特点：pH值：黄色6.6－橙色－8.0红色。蜡样芽胞杆菌的菌落长成粉红色；卵黄液含卵磷脂：（卵磷脂酶：＋）：菌落周围环绕粉红色的晕。多粘菌素B：抑制杂菌

3.3胰酪胨大豆多黏菌素肉汤：见附录A中A.3：有酪蛋白酶分解酪蛋白，多黏菌素抑杂菌；3.4营养琼脂：见附录A中A.4：纯培养，证实试验，

形成白蜡状的大R形菌落3.5过氧化氢溶液：见附录A中A.5。－－H2O2酶+；3.6动力培养基：见附录A中A.6：+；3.7硝酸盐肉汤：见附录A中A.7。硝酸盐还原+、—，分型。

3.8酪蛋白琼脂：见附录A中A.8：有酪蛋白酶分解酪蛋白，使菌落周围有透明圈。3.9硫酸锰营养琼脂培养基：见附录A中A.9。蛋白质毒素结晶试验—；3.100.5%碱性复红：见附录A中A.10

－－菌体内红色蛋白结晶：－;苏云金芽胞杆菌：＋

3.11动力培养基：见附录A中A.11

3.12糖发酵管：见附录A中A.12，木糖分解：—；厌氧条件下能发酵葡萄糖3.13V-P培养基：见附录A中A.13，不定+、—，分型3.14胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂：见附录A中A.14

β溶血+，菌落为白色毛玻璃状；苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象；多数炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌为不溶血

/B.cereus.html

3.15溶菌酶营养肉汤：见附录A中A.15.耐受生长+；巨大芽胞杆菌48h不生长。3.16西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.16:+、—种内分型用。

3.17明胶培养基：见附录A中A.17.明胶液化＋

性状/生化性状动力产卵磷脂酶酪蛋白酶过氧化氢酶阳性＋

β－溶血液化明胶在厌氧条件发酵葡萄糖

甘露醇和木糖发酵：－葡萄糖利用（厌氧）

++++—V-P试验++++—甘露醇产酸————+溶血（羊红细胞）+++—/+—根状生长——+——蛋白质毒素晶体—+———注：+表示90%～100%的菌株阳性；-表示90%～100%的菌株阴性；+/-表示大多数的菌株阳性；-/+表示大多数的菌株表1蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别检验程序4蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）4.1检验程序蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序见图1。第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数；检样25g(或25mL)样品+225mL稀释液，均质报告10倍系列稀选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，涂布MYP琼脂平板典型菌落计数及确定鉴定30℃±1℃24h～48h每个稀释度以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接种量分别移入三块MYP琼脂平板，共计6~9块平板。甘露醇（－）卵黄（＋）多粘菌素培养基，粉红色菌落和晕蜡样芽胞杆菌检验过程：样品制备——稀释——接种——分离培养——纯培养——确定鉴定包括染色镜检、生化鉴定种间、动力试验+、甲/乙型溶血试验毛玻璃状+、溶菌酶耐性试验+、蛋白毒素结晶试验+、种内生化分型试验（选做）——计算——结果与报告。典型菌落计数和确认：选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。计数：1个或2个连续稀释度的平板菌落数（均）在20CFU～200CFU之间且（均）有典型菌落的，分别按照公式一和公式二计算。如下：

菌落计算公式（1）

T

=AB/Cd式中：

T—样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；

A—某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；

B—鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；

C—用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；d—稀释因子。

菌落计算公式（2）

式中：T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；A1——第一稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；A2——第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；1.1——计算系数（如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；d——稀释因子（第一稀释度）。A1B1C1+A2B2C21.1dT=第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。5蜡样芽胞杆菌MPN计数法（第二法）多一步增菌检样25g(或25mL)样品+225mL稀释液，均质报告10倍系列稀释选取2个～3个适宜连续稀释度的样品匀液，各吸取1mL，分别接种于3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤确定鉴定30℃±1℃24h～48h接种MYP琼脂平板30℃±1℃48h±2h查MPN表增菌每一稀释度接种3管，每管接种1mL，计6~9管。查MPN检索表（见附录B），报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。每管取一环培养物接种一块平板，计6~9块平板。复习思考题1、试述蜡样芽胞杆菌的形态染色特点？引起食物中毒的量和主要食品？2、蜡样芽胞杆菌在普通营养琼脂平板上形成菌落的特点？在鲜血琼脂平板上形成菌落的特点？在甘露醇－卵黄－多粘菌素(MYP)琼脂培养基上形成菌落的特点？3、对蜡样芽胞杆菌的检验程序加以说明。4、解释并自己举例计算食品样品蜡样芽胞杆菌检验的计算公式（1）和公式（2）的结果报告

。

A1B1C1+A2B2C21.1dT=T=AB/Cd后面是03年国标甘露醇（－）卵黄（＋）多粘菌素培养基，粉红色菌落和晕纯培养，证实试验白蜡状的大R形菌落检验程序（菌数测定）（分离培养）6、说明1）菌数测定

*样品做成10-5～10-1的稀释液*取各稀释液0.1ml*接种两个甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂平板

(36±1)℃培养12—20h*选取适当菌落数的平板进行计数

--粉红色(表示不发酵甘露醇)周围环绕粉红色晕的(表示产生卵磷脂酶)菌落*计算后*从中挑取5个此种菌菌落做证实试验。2)分离培养（－－纯培养）

(稀释)液检样－－选择性培养基(MYP)上－－(36±1)℃－－12～20h，挑取可疑的蜡状芽孢杆菌（粉红色带晕的）菌落接种于肉汤/营养琼脂做成纯培养，然后做证实试验。www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html

3）证实试验

(1)形态观察

本菌为G＋有芽胞的大杆菌。芽孢呈卵圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端直径不大于菌体。

(2)培养特性观察

在肉汤中生长混浊，常稍有菌膜或壁环，振摇易乳化；在普通琼脂平板上生成R形融蜡状的菌落，不透明，表面粗糙，边缘不齐。(3)生化性状及生化分型

①生化性状

动力产卵磷脂酶酪蛋白酶过氧化氢酶阳性