第二节 基因克隆的基本过程

第二节基因克隆的基本过程1.分1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定2.选3.接4.转5.筛

第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接1、黏端连接2、平端连接3、黏平连接

第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接1、黏端连接

⑴单一相同黏端连接⑵不同黏端连接⑶产生黏端连接1、黏端连接重组体⑴单一相同黏端连接:载体自连目的DNA自连

第二节基因克隆的基本过程三、目的DNA与载体连接1、黏端连接⑴单一相同黏端连接用同一种RE切割目的DNA和载体缺点：目的DNA多拷贝载体自身环化目的DNA双向插入

⑴单一相同黏端连接载体自身环化:

碱性磷酸酶预处理线性化载体DNA，载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。

第二节基因克隆的基本过程三、目的DNA与载体连接1、黏端连接⑴单一相同黏端连接用同一种RE切割目的DNA和载体缺点：目的DNA多拷贝载体自身环化目的DNA双向插入

VectorEcoRIEcoRIEcoRIVectorREdigestionREdigestionLigationRecombinantvectorRecombinantvectorRecombinantvectorEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI—单酶切基因片段的连接:连接没有方向性⑴单一相同黏端连接目的基因双向插入

三、目的DNA与载体连接1、黏端连接⑴单一相同黏端连接⑵不同黏端连接EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI不同黏端连接EcoRI+HindIIIGAATTCAAGCTTCTTAAGTTCGAATargetDNA

AATTCA

GTTCGA

VectorG

AATTCCTTAA

GTTCGA

AEcoRI+HindIIIGAGCTTCTTAA

AAAGCTTCTTAAGTTCGAAGAATTCAAGCTTDNALigase⑵不同黏端连接TargetgeneEcoRIBamHIEcoRIBamHIVectorVectordigestiondigestionLigationVectorEcoRIBamHI—双酶切基因片段的连接:有方向性⑵不同黏端连接

第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接1、黏端连接⑴单一相同黏端连接⑵不同黏端连接⑶产生黏端连接①人工接头法②加同聚物尾法③PCR法

1、黏端连接⑶产生黏端连接①人工接头法：化学合成含有RE切点的平端寡核苷酸片段。与平端DNA连接，再用RE切割，产生粘性末端，而后进行黏端连接。

1、黏端连接⑶产生黏端连接①人工接头法：5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA

T(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体⑶产生黏端连接①人工接头法②加同聚物尾法

⑶产生黏端连接①人工接头法②加同聚物尾法③PCR法：

在引物的5′端设计酶切位点带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

5’--3’GCTAGCTGG

-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGACCEcoRI位点BamHI位点两端为粘性末端的目的DNAPCRTargetDNAsequence

AATTC

5’--3’GCTAG

-5’3’-

GCEcoRI+BamHI⑶产生黏端连接①人工接头法②加同聚物尾法③PCR法

T-Vector5'5'TT5'5'AAPCRproductRecombinantvector

AATTLigation⑶产生黏端连接①人工接头法②加同聚物尾法③PCR法④T-A克隆:在使用TaqDNA聚合酶进行PCR时，扩增产物的3’端可添加上一个单独的腺苷酸残基（A）而成为黏端，这样的PCR产物可直接与带有3’T的线性化载体（T载体）连接，此即T-A连接。⑶产生黏端连接④T-A克隆三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取（二）载体的选择与构建（三）目的DNA与载体连接1、黏端连接2、平端连接缺点：载体自身环化目的基因双向插入基因多拷贝

AATTC

GGCTTAA

CTTAAGGAATTCDNALigaseTargetDNAVector三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤（一）目的DNA的分离获取（二）载体的选择与构建（三）目的DNA与载体连接1、黏端连接2、平端连接3、黏平连接

定向克隆基因克隆的基本过程1.分1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定2.选3.接4.转5.筛第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接四、重组DNA转入受体细胞宿主细胞大肠杆菌JM109遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，重组子稳定；不存在特异的内切酶体系降解外源DNA-----DNA(蛋白质)降解系统缺陷株对宿主细胞的要求：容易接受重组DNA分子---感受态细胞（处于易于接纳外源物质状态的细菌）对载体的复制无严格的限制,保证外源DNA长期稳定地遗传(或表达)第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接四、重组DNA转入受体细胞1、转化2、转染3、感染四、重组DNA转入受体细胞1、转化：将重组质粒导入细菌或酵母细胞的过程。转化方法：化学方法(氯化钙法)物理方法(电穿孔法)用CaCl2处理大肠杆菌，Ca2+

与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。一般用于细菌的转化氯化钙转化法四、重组DNA转入受体细胞1、转化：化学方法(氯化钙法)将大肠杆菌细胞置于冰冷的CaCl2溶液中，然后瞬间加热，外源DNA随即转入大肠杆菌。用氯化钙法使大肠杆菌处于感受态，从而将外源导入细胞，至今仍然是应用最广的方法。第二节基因克隆的基本过程四、重组DNA转入受体细胞1、转化：将重组质粒导入细菌或酵母细胞的过程。2、转染：将外源DNA直接导入真核细胞的过程。（包括噬菌体导入细菌的过程）转化方法：化学方法(磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法)物理方法(显微注射法，电穿孔法)第二节基因克隆的基本过程四、重组DNA转入受体细胞2、转染：电穿孔法第二节基因克隆的基本过程四、重组DNA转入受体细胞2、转染：脂质体转染法

脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25－1000nm不等。第二节基因克隆的基本过程四、重组DNA转入受体细胞2、转染：脂质体转染法原理：脂质体分子的阳离子部分与带有负电荷的核酸（磷酸盐上的负电荷）相连，形成脂质体/核酸复合物。该复合物所剩下的所有正电荷还可与细胞膜表面的负电荷相连，从而提高转染效率。经过细胞内吞进入细胞内。第二节基因克隆的基本过程四、重组DNA转入受体细胞2、转染：脂质体转染法转染过程：(1)培养细胞24小时，密度达到50～60%。

(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物。

(3)向每孔中直接加入DNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时。

第二节基因克隆的基本过程四、重组DNA转入受体细胞1、转化：质粒→细菌质粒→酵母2、转染：DNA→真核细胞

噬菌体DNA→细菌3、感染：噬菌体颗粒→细菌病毒颗粒→真核细胞

优点：转移效率较高。基因克隆的基本过程1.分1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定2.选3.接4.转5.筛第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接四、重组DNA转入受体细胞第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接四、重组DNA转入受体细胞五、重组体的筛选与鉴定筛选策略：先筛选出带有载体的克隆；然后筛选出带有重组载体的克隆；最后鉴定出带有目的DNA的克隆。第二节基因克隆的基本过程一、目的DNA的分离获取二、载体的选择与构建三、目的DNA与载体连接四、重组DNA转入受体细胞五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法2、序列特异性筛选法3、亲和筛选法五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：

五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：

含有载体的细菌第二节基因克隆的基本过程五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：载体上需要有两个筛选标志外源DNA插入其中一个筛选标志使其失去筛选作用另一个筛选标志仍发挥作用（2）利用基因的插入失活特性筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：pBR3224363bpTetRAmpRBamHIOriginpBR3224363bpBamHIOriginBamHIOriginpBR3224363bpBamHIBamHIBamHI+如何得到含有重组质粒的细菌？（2）利用基因的插入失活特性筛选：筛选策略：先筛选出带有载体的克隆；然后筛选出带有重组载体的克隆；最后鉴定出带有目的DNA的克隆。（2）利用基因的插入失活特性筛选：筛选策略：先筛选出带有载体的克隆；然后筛选出带有重组载体的克隆；最后鉴定出带有目的DNA的克隆。Plate+ampicillinPlate+ampicillinandtetracycline重组质粒Transfer第二节基因克隆的基本过程五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：（3）利用标志补救筛选：载体上的标志基因表达，补救宿主细胞的缺陷基因，使细胞在选择性培养基上存活。1、遗传标志筛选法（3）利用标志补救筛选：第二节基因克隆的基本过程五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选（3）利用标志补救筛选：乳糖操纵子载体带有β-半乳糖苷酶C端（α片段）的编码序列细胞带有β-半乳糖苷酶N端（ω片段）的编码序列有活性的β-半乳糖苷酶α-互补（3）利用标志补救筛选：α-互补（3）利用标志补救筛选：α-互补（3）利用标志补救筛选：α-互补白色克隆重组质粒蓝色克隆质粒无目的基因平板上含有青霉素和X-gar.没有外源基因插入，菌落呈现蓝色；如果外源基因插入位于LacZ基因内部的MCS，则菌落呈白色。（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选（3）利用标志补救筛选：蓝白筛选X-gal蓝色产物

-半乳糖苷酶第二节基因克隆的基本过程五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选：（2）利用基因的插入失活特性筛选：（3）利用标志补救筛选：（4）利用噬菌体的包装特性筛选：coscos12bp12bp48500bpNonessentialportionforreplicationLong(left)armShort(right)arm

第二节基因克隆的基本过程五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（4）利用噬菌体的包装特性筛选：重组λDNA的长度为其野生型长度的75%～105%时，才能包装形成有活性的噬菌体颗粒。第二节基因克隆的基本过程五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法（1）利用抗生素抗性标志筛选（2）利用基因的插入失活特性筛选（3）利用标志补救筛选（4）利用噬菌体的包装特性筛选2、序列特异性筛选第二节基因克隆的基本过程五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法2、序列特异性筛选（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸杂交法（4）DNA测序法五、重组体的筛选与鉴定2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：提取阳性克隆的重组DNA从克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。DNA

Marker载体重组载体五、重组体的筛选与鉴定2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：提取阳性克隆的重组DNA五、重组体的筛选与鉴定2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：提取阳性克隆的重组DNA

Linearvector(2700bp)insert(300bp)

M空质粒重组质粒NcoIHindIII2700bp300bp提取阳性克隆的重组DNARE消化电泳有无DNA片段的插入；插入片段的大小五、重组体的筛选与鉴定2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段五、重组体的筛选与鉴定2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在a、提取阳性克隆重组DNAb、用特异引物进行PCRc、电泳PCR产物d、判断PCR产物是否与外源DNA一致NcoIHindIII2700bp300bp五、重组体的筛选与鉴定2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在（3）核酸杂交法：原位杂交鉴定阳性克隆五、重组体的筛选与鉴定2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在（3）核酸杂交法：原位杂交鉴定阳性克隆（4）DNA测序法：最准确的鉴定方法五、重组体的筛选与鉴定1、遗传标志筛选法2、序列特异性筛选（1）RE酶切法：酶切鉴定插入片段（2）PCR法：直接鉴定目的DNA的存在（3）核酸杂交法：原位杂交鉴定阳性克隆（4）DNA测序法：最准确的鉴定方法3、亲和鉴定法：抗原-抗体反应Ab基因克隆的基本过程1.分1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定2.选3.接4.转5.筛基因的研究蛋白质研究生物制药基因诊断基因治疗医学转基因植物测序功能突变/改造序列结构分析功能基因工程以基因克隆为基础第三节克隆基因的表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。蛋白表达系统是指由外源基因、载体、宿主细胞和辅助成分组成的体系。重组子目的基因的mRNA表达蛋白质

转录：DNA作为模板直接指导RNA分子生物合成的过程.DNA模板,RNA聚合酶,NTP翻译：mRNA作为模板直接指导蛋白质生物合成的过程。mRNA，核糖体，tRNA基因表达原核生物基因的表达真核生物基因的表达*连续基因*断裂基因：内含子与外显子*染色体位于类核，与细胞浆相通*染色体位于细胞核，核膜使其与细胞浆相隔#一种RNA聚合酶催化转录#三种RNA聚合酶催化转录#转录与翻译同时进行#翻译后蛋白产物需翻译后修饰#mRNA无需加工#mRNA要经过剪接去除内含子，加帽、加尾#转录以多顺反子为单位#转录以单顺反子为单位#转录与翻译分开进行#翻译的蛋白产物无翻译后修饰第三节克隆基因的表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。蛋白表达系统是指由外源基因、载体、宿主细胞和辅助成分组成的体系。原核表达系统ProkaryoticexpressionsystemEukaryoticexpressionsystem真核表达系统大肠杆菌枯草芽胞杆菌链霉菌酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞转化宿主细胞RecombinantvectorpromoterTargetgeneProteinsTransformation/Transfection第三节克隆基因的表达1、原核表达体系：

主要利用细菌表达外源蛋白，最早被研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。（1）表达载体特点：①克隆载体②转录调控序列(强启动子)③翻译控制序列(SD序列和翻译起始点)④合理的MCS大肠杆菌表达载体的基本组成R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列MCS第三节克隆基因的表达1、原核表达体系：（1）表达载体特点：①克隆载体②转录调控序列(强启动子)③翻译控制序列(SD序列和翻译起始点)④合理的MCS强启动子终止子SD序列oriPT7SDMCSTerminatorProkaryoticExpressionPlasmid

ProkaryoticpromoterLacIstartpiontAmpicillinresistance克隆元件：表达元件：插入位点复制原点筛选标记（1）表达载体特点：成熟型融合型分泌型减少原核细胞对外源蛋白的降解------天然完整蛋白-----融合蛋白----分泌性蛋白（2）表达载体类型：oripromoterSDMCSExpressionvector特点：外源基因需携带ATG和TAA只表达目的基因编码的氨基酸产生天然蛋白，容易被降解，因此产量小，也可能不稳定。缺点!PForeignDNA①成熟型表达载体：

表达载体含有一段编码原核蛋白的基因顺序，使表达的蛋白质N端或C端带着一小段原核多肽。

②成熟型表达载体：融