潘血红蛋白的提取和分离

本课题学习目标

简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用？2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法

4、课题难点：①样品的预处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1.分离生物大分子的基本思路：

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：基础知识

1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力

基础知识（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理相对分子质量较大的分子经过路程短，流动快；相对分子质量较小的分子经过路程长，流动慢。4.具体过程洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示

（二）缓冲溶液1.概念:

在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液。

能够抵制外界的酸和碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制:

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:磷酸缓冲液

利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)思考：说出人体血液中缓冲液

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3

（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：

电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.常用类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳4.影响蛋白质分子运动速度的因素:

决定运动方向决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳(十二烷基磺酸钠)

在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量。

SDS带负电荷多的，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。二、实验操作样品处理粗分离纯化纯度鉴定

血液组成成分

1.洗涤红细胞

2.释放血红蛋白

3.分离血红蛋白

4.透析血红蛋白二、实验操作血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（除水，90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.血液有哪些成分？1.用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白※知识回顾血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：返回1、红细胞的洗涤阅读思考：洗涤的目的是什么？（P67）

洗涤的方法是什么？洗涤过程：血液100mL低速离心2min红细胞血浆红细胞缓慢搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色3g柠檬酸钠吸出血浆5倍体积生理盐水洗涤干净的标志是什么？初次离心后的结果3次洗涤后的结果返回2、血红蛋白的释放阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：①蒸馏水的作用是______________________________。②加入甲苯的作用是____________________________。③充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂磁力搅拌器3、分离血红蛋白溶液①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。红细胞混合液高速离心10min滤纸过滤烧杯离心管分离过程甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次返回记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀4、透析

①过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。20mmol/L磷酸缓冲液1mL1mL1mL利用透析袋透析返回纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填教材图5－193.样品的加入和洗脱凝胶色谱操作:1、凝胶色谱柱的制作

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。2、凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装配好的凝胶柱

④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。2、凝胶色谱柱的装填50cm高3、样品加入与洗脱

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：正确的加样操作是：

1、不要触及并破坏凝胶面。

2、贴壁加样。

3、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白注意事项1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡.3.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。思考下面的问题：

1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？

2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？

血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明