头孢曲松钠对盲肠菌群的影响

头孢曲松钠对盲肠菌群的影响

人体肠道中存在大量复杂的正常菌群，有利于养分、免疫和生物抵抗。研究表明当正常菌群失衡后对机体的正常代谢及抗感染能力有影响,易引发肠道感染,但其机制不明。近年来探讨正常菌群与肠道黏膜免疫的关系成为免疫学及相关学科研究的热点,肠道菌群失衡与免疫之间的关系越来越受到关注,但缺乏合适的动物肠道菌群失衡模型。关于模型研究目前国内外实验集中在无菌动物模型上,这种模型是一种菌群缺陷模型,解析不了菌群失衡后机体的变化。现有的普通动物模型是通过检测4～6属菌群的变化作为参考标准的,这种模型既反映不了肠道起稳态作用的优势菌群状况又难以较全面解释菌群与机体的互作关系,所以我们选择对机体微生态稳态起作用的肠道优势菌群属为研究对象,通过抗生素干预方法建立肠道优势菌群属不同程度的失衡模型,为微生态的深入研究奠定基础。1材料和方法1.1试验对象Babl/c小鼠,6～8周龄,雌雄各半,体重(18±2)g,购自大连医科大学实验动物中心。1.2试剂1.2.1抗生素头孢曲松钠,河北石家庄中诺药业(批号08088229)。1.2.2培养基和试剂双歧杆菌选择性培养基(BS)、乳酸杆菌选择性培养基、金黄色葡萄球菌选择性培养基(Baird-Paker琼脂基础)、孟加拉红选择性培养基和EG基础培养基,以上培养基均购自青岛海博生物科技有限公司;伊红美兰培养基(EMB),购自上海市医学化验所试剂厂;类杆菌选择性培养基(Bds)、肠球菌选择性培养基(EC)、链球菌选择性培养基(TATAC)、韦荣球菌选择性培养基(VS)、消化球菌选择性培养基(PMS)、梭杆菌选择性培养基(FS)、优杆菌选择性培养基(CS)和稀释液,购自北京天德泰医疗器械公司和大连英祥玻化物质经营中心。1.3方法1.3.1适应性培养方法将实验动物随机分为对照组、轻度菌群失衡组和重度菌群失衡组,每组10只,雌雄各半。Balb/c小鼠从动物实验中心取回后,先进行适应性培养2d;对照组小鼠用无菌水灌服,每次0.2ml,每日2次,间隔6h,连续8d;轻度失衡组小鼠用125mg/ml头孢曲松钠灌服,方法同上;重度失衡组小鼠用400mg/ml头孢曲松钠灌服,方法同上。小鼠饲养条件清洁干净,室温18～20℃。头孢曲松钠剂量选择为亚致死剂量,重复实验8次。1.3.2稀释液的稀释取新鲜粪便,用无菌L棒挑取中间部分,放入含玻璃珠的无菌青霉素小瓶内,每次采样量约0.5g。加4.5ml稀释液于小瓶内,放于涡旋振荡器上振荡至粪便均质化,此为10-1稀释度。取无菌试管7个,并进行编号2～8,分别加入9ml稀释液,然后从匀浆小瓶取出1ml,放于第2管内,充分混匀,即为10-2,依次类推进行倍比稀释,至10-8稀释度备用。1.3.3滴种及稀释度的测定将培养基平板放于37℃培养箱内烘干过夜,使平板表面无水滴。选取合适的稀释度进行滴种,从高稀释度开始,每次吸取20μl混匀的稀释菌液,滴种于各平皿相应的稀释度。每个稀释度重复3次。滴种结束后,待液滴吸收,平板反转,分别进行需氧和厌氧培养。1.4观测指标1.4.1大鼠抑郁每天对小鼠摄食量、饮水量、行动活跃程度和皮毛光泽度进行观察。1.4.2盲肠变化对盲肠体积、重量及盲肠内容物变化进行记录。1.4.3肠菌群分析待菌落长出后,以菌落形态、革兰染色和生化反应鉴定细菌。2结果2.1小鼠体征特征正常对照组,摄食饮水正常,行动活跃,皮毛平整光滑。优势菌群失衡组与对照比较,小鼠体征特征呈现:摄食饮水下降,精神萎靡不振,毛色无光,伴有粘液便,且重度菌群属失衡组与轻度菌群属失衡组相比症状加重。2.2盲肠变化优势菌群属失衡组与对照比较,盲肠体积增大,盲肠指数增高,并可见盲肠内容物稀薄。见图1,图2。2.3类杆菌属降至菌株数量的降小鼠在头孢曲松钠连续灌胃8d后,轻度菌群属失衡小鼠肠道双歧杆菌属、链球菌属和韦荣球菌属数量降至105左右,类杆菌属降至104左右,消化球菌属降至103左右,而其他菌属如乳酸杆菌属、肠球菌属和肠杆菌属等数量显著降低;重度菌群属失衡小鼠肠道双歧杆菌属、乳酸杆菌属、类杆菌属及肠球菌属等肠道优势菌群的数量检不出,而肠杆菌属、链球菌属的数量被抑制在103CFU/g以下(见表1)。3讨论3.1小鼠肠道菌群检测抗生素在抗感染中的广泛应用是导致机体肠道正常菌群失衡的最重要原因之一,因此应用抗生素建立肠道菌群失衡模型既具有重要的科学意义又具有重要的现实意义。本实验选择多种临床常用的抗生素如如青霉素,经过多次实验选择了口服头孢曲松钠作为干预肠道菌群因素。头孢曲松钠是一种广谱抗生素,菌群几乎没有耐药性,毒性低,是理想的建立菌群失衡的干预物质,建立模型中选择了小鼠亚致死剂量8g/(kg·d)得到了上述结果。大于此剂量小鼠半数死亡。实验中肠杆菌属与链球菌属有一定数量的检出(2.239±0.088,3.000±0.000),可能是肠杆菌属与链球菌属中部分菌株有耐药所致,但与健康小鼠肠道同属菌群相比差异有统计学意义(P<0.01),表明肠道中肠杆菌属与链球菌属被大幅度抑制。健康小鼠肠道霉菌的检出在实验组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05),可能霉菌对头孢曲松钠不敏感。肠道作为机体巨大的细菌库,寄居着1014个细菌,种类在100～400。目前,可培养状态的菌种在20种内,建立高通量肠道优势菌群检测对全面解析肠道菌群与机体互作关系具有十分重要意义。随分子学方法的出现,国内外正在探索应用宏基因组方法分析肠道菌群的全貌,但这种方法有赖于对肠道所有菌群的单个菌株的全基因组弄清后才能实现,还有很长的路走。本实验室在长期的实践中摸索了一套肠道可培养状态优势菌群的测定方法,在1周内对14种菌属培养计数方法稳定,可作为研究肠道菌群的方法之一,是目前探索菌群与机体互作关系研究的基本方法。此外,本方法检测的肠道菌群属的种类、数量占目前研究肠道全部可培养状态菌群种类的70%,基本能反映肠道微生态系全貌。本实验应用头孢曲松钠8g/(kg·d)给小鼠口服连续8d,得到了小鼠肠道优势菌群重度失衡,实验过程每天观察的优势菌群直到测不出的水平,结果稳定。应用头孢曲松钠5g/(kg·d)给小鼠口服连续8d,得到了小鼠肠道优势菌群轻度失衡,检测的肠道优势菌群的量接近健康小鼠肠道优势菌群一半数量,结果稳定。实验中发现,菌群失衡小鼠肠道内有酵母菌生长,提示酵母菌可能在菌群失衡中具有一定的意义,也预示抗生素的大量应用会使真菌感染出现,应进一步深入研究。正常情况下,肠道菌群与机体形成了相互依赖和相互制约的微生态平衡系统,细菌在肠黏膜粘附定植形成膜菌群,构成了肠道的生物屏障。正常菌群的失衡与肠道黏膜上皮,免疫的网络以及肠道防御屏障的关系是微生态学研究的核心之一,国内外研究集中在菌群失衡与免疫学的多,而在肠道黏膜屏障,黏膜上皮的变化少,只有对肠道黏膜上皮,免疫的网络以及肠道防御屏障进行系统