2型糖尿病大鼠模型的建立

2型糖尿病大鼠模型的建立

糖尿病严重危险是人类死亡和致死于共病的主要原因之一，超过90%的2型糖尿病（t2dt）。T2DM的发病包括两大机制:胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞功能受损。建立理想的接近人类发病特点的T2DM动物模型是研究T2DM的前提,其中建立可行的IR动物模型以及评价胰岛素敏感性的方法是关键。目前尚无理想的价格相对低廉的类似于人类2型糖尿病的动物模型。由于高脂饮食喂养不仅可诱导胰岛素抵抗,还能对胰岛β细胞功能造成一定损害,本研究借鉴前人的经验,使用长期高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(STZ)和弗氏完全佐剂(CFA)的方法造模,并采用当前判断IR的“金标准”-高胰岛素-正常血糖钳夹实验(钳夹实验)评价该模型的胰岛素敏感性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1中心提供材料中心提供服务中心清洁级♂SD大鼠90只,由安徽医科大学实验动物中心提供。在恒温(22℃)、相对湿度65%～70%、光照周期12h∶12h中适应饲养1周后,体重达170～190g开始实验。1.1.2柠檬酸缓冲液fpsSTZ购自Sigma公司,临用前溶解在0.1mol/L柠檬酸缓冲液中,pH4.5。CFA购自Sigma公司。甘油三酯诊断试剂盒,德国罗氏公司产品。胰岛素诊断试剂盒,美国DPC公司产品。1.1.3血糖仪、评估泵小动物血压测定仪,美国哈佛大学研制的179型。血糖仪为美国强生公司产品。蠕动泵,保定兰格恒流泵有限公司产品。PE50导管,深圳市凯思特精工塑料有限公司产品。1.2方法1.2.1水相的制备和干燥参照文献加以改进。花生油220g于一容器加热到80℃时加入184g吐温80搅匀制成油相。同时另一容器中加入水140g、蔗糖100g、全脂奶粉60g,食盐4g和丙二醇18.4g,搅拌加热至60℃,加入4g脱氧胆酸钠,充分搅拌加热直至完全溶解制成水相。将水相倒入油相中充分混匀。冷却后加入复合维生素0.8g,复合微量元素0.4g充分搅匀,即制成脂肪乳剂(脂肪占总热量的75%,碳水化合物占15%,蛋白质占10%)。制成的乳剂于4℃储藏,每天经40℃水浴,充分搅拌后使用。1.2.2血糖含量的检测随机取70只为高脂喂养组,予高脂肪乳剂灌胃10ml/kg;另20只为对照组,予等量蒸馏水灌胃。两组自由进食标准颗粒饲料(由安徽医科大学实验动物中心配置,蛋白质占总热量的21.5%,脂肪占总热量的3.2%,碳水化合物占总热量的57.9%),每周称量体重(BW),连续5个月后用小动物血压测定仪测收缩压(SBP),取眼眶静脉血测甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIns)。高胰岛素-正常血糖钳夹实验:取对照组和高脂组大鼠各6只,禁食不禁水12h后称重,以0.56mol/L水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉。将大鼠仰位固定于恒温手术台上(保持体温在37℃左右)剪开左颈部皮肤,分离左颈外静脉,结扎远心端,切口,近心端方向插入PE50导管(插管中预先注入5×104U/L肝素生理盐水溶液),结扎固定后连接一个三通管,出口端与静脉导管相接,一进口端与输注胰岛素的蠕动泵(进口端接40U/L的胰岛素)相连,另一进口端与微量注射仪的注射器(内装0.56mol/L葡萄糖溶液)相接。剪开右颈部皮肤(近中线),分离颈总动脉,结扎远心端,动脉夹夹住近心端后,切口,于近心端方向插入PE50导管(插管中预先注入5×104U/L肝素生理盐水溶液以润滑插管),结扎固定后亦连接一个三通管以取血样,两个进口端用肝素帽封闭。静置30min后先测定基础血糖值(BBG),然后以8mU/(kg·min)恒速输注胰岛素,6mg/(kg·min)输注0.56mol/L葡萄糖溶液,10min后取血测定血糖值(用1ml盛有0.2ml的1×106U/L肝素钠注射器从右侧三通管的一个进口端回抽0.4ml血后,用注射器从另一进口端取一滴血用于纸片法测血糖,然后将回抽的0.4ml血连同肝素钠推入体内),调整葡萄糖输注率,使血糖维持在BBG±0.5mmol/L,每8min测定血糖1次,当连续3次血糖值均在上述范围时,即达到稳定状态。达到稳态后,每5min测血糖一次,记录稳态下最后6次葡萄糖灌流速度(GIR)的平均值作为GIR[mg/(kg·min)]。1.2.3随机血糖的测定高脂组大鼠(n=64只)空腹6h后腹腔注射STZ12mg/kg,次日腹腔注射CFA0.5ml/kg,7d后尾静脉采血用血糖仪测定随机血糖,以随机血糖>11.1mol/L为T2DM成模标准,血糖不达标的重复上述步骤,3次仍不达标者,退出该实验。空白对照组仅注射等量枸橼酸缓冲液。1.2.4指标检测生化法测TG、FBG,化学发光法测FIns。1.3fins与胰岛素敏感指数用SPSS11.0软件进行统计学处理实验数据,数据用x¯±sx¯±s表示,计量资料的两组间比较采用两样本t检验,FIns和胰岛素敏感指数(ISI)呈非正态分布,进行自然对数转换后比较,ISI=LN1/(FIns×FBG)。2结果2.1bw、sdp和tg组脂肪乳剂喂养5个月后,高脂组大鼠BW、SBP及TG均较对照组升高,差异有显著性(P<0.05),见表1。2.2组趋势比较见表2与对照组相比,高脂组大鼠FBG有升高趋势,但差异无显著性(P>0.05);高脂组FIns升高,ISI下降,差异均有显著性(P<0.05)。见表2。2.3组高脂组高脂组差异高胰岛素-正常血糖钳夹实验显示,对照组GIR为(10.87±1.15)mg/(kg·min),高脂组为(6.05±1.41)mg/(kg·min),高脂组较对照组明显降低,差异有显著性(P<0.05)。2.4造模前后死亡3次注射前后未达标64只高脂喂养大鼠腹腔注射STZ和CFA,2只大鼠在造模前后死亡,9只大鼠3次注射后仍未达标,退出实验。共有53只大鼠随机血糖>11.1mol/L,成模率为85%(53/62)。3大鼠胰岛素活性的变化建立T2DM大鼠模型的方法有很多,目前国内应用较多的方法是小剂量、多次使用STZ加高脂膳食。殷峻等发现高脂喂养第4～5月时大鼠体重达高峰,出现明显胰岛素抵抗,继续喂养则体重出现下降趋势,故本研究将高脂喂养的时间定在5个月。本课题的前期研究发现以花生油为主制备的高脂乳剂灌胃后,大鼠血清HDL-C水平显著降低,血清TG、游离脂肪酸(FFA)和肝脏FFA含量显著增加。高浓度的FFA在IR病理过程中占重要地位,即“脂毒性理论”,其机制是:①影响胰岛素的合成和分泌,研究表明,血浆胰岛素浓度的升高与游离脂肪酸浓度有着密切的关系。②促进胰岛β细胞凋亡,一些研究结果表明,细胞内甘油三酯长期堆积可以导致β细胞功能障碍,细胞破坏,数量减少,而细胞凋亡可能参与了这一过程。③影响胰岛素的信号转导。④游离脂肪酸可抑制胰岛素在肝脏的清除导致高胰岛素血症。⑤游离脂肪酸可抑制组织摄取和利用葡萄糖,其机制可能与降低肌肉组织细胞膜上GLUT的活性以及基因表达有关。IR是指全身性胰岛素敏感性下降的一种状态,即正常浓度的胰岛素不能发挥相应效应。判断机体有无IR,必须准确地测定胰岛素敏感性。最精确的评价方法是高胰岛素正常血糖钳夹技术。本研究应用此技术发现高脂喂养5个月后的SD大鼠GIR显著低于对照组,表明高脂组大鼠的胰岛素敏感性明显降低,即存在着胰岛素抵抗。高脂膳食大鼠的FIns明显高于正常大鼠,说明存在高胰岛素血症,亦反映机体胰岛素敏感性降低。本研究中还发现,高脂组大鼠的体重、SB