植物细菌性青枯病与根结线虫病的复合病害控制

植物细菌性青枯病与根结线虫病的复合病害控制

植物细菌的绿色损害是由绿穗菌引起的毁灭性土传病，通常发生在热带和亚热带地区。这在中国南方的五个省份报告，危害严重。由于这类病害的寄主范围广,且其病原存在较大的变异,目前尚无有效的化学防治方法。近十几年来,生物防治作为一种很有潜力的病害控制手段,在青枯病的生物控制上取得了一定的进展,但大多研究仅针对青枯病原本身,极少考虑其他生物和环境因素的影响。青枯病病害系统相当复杂,许多外界因素(如其他生物、土壤质地等)对病害的发生、流行都有很大影响。普遍认为,植物寄生线虫能够加重青枯病害的发病程度,近年的研究也发现,根结线虫不仅给青枯病的发生创造了更多的伤口,还与青枯菌协同作用,形成侵染性更强的复合性病害。廖月华等的研究表明,蔬菜青枯病的发生与土壤中根结线虫量呈正相关。因此,在青枯病的防治实践中,充分考虑根结线虫这一重要因素,建立“主治青枯,兼防线虫”的复合病害防治思路具有积极意义。本试验利用番茄根系的拮抗菌,分别以青枯病菌和根结线虫为靶标,筛选能有效抑制两种不同病原的拮抗菌株,并尝试利用活性菌株减缓复合侵染病情,旨在为细菌性青枯病与根结线虫的复合病害控制寻找一条有效途径。1材料和方法1.1分离自番茄根EN系列菌株参照内生细菌分离方法分离自受根结线虫侵染的番茄根系;S系列菌株分离自番茄根表。青枯病菌菌株分离自病株茎部,并经TTC平板和回接法测定其致病力。供试根结线虫群体以南方根结线虫(Meloidogyneincognita)为主,于温室中感病番茄繁殖。1.2波斯品种早丰(西安阳光种业有限公司)。1.3培养基NA培养基用于病原细菌分离和拮抗活性测定;PDA用于拮抗菌分离。1.4抑菌圈大小测定移取300μL番茄青枯病菌的NB培养物至灭菌的NA平板上,均匀涂布后风干,将分离的细菌菌株点接于平板,于28℃下培养48h后观察、测量抑菌圈大小。1.5试验用病犯病株番茄种子播于装有无菌土(菜园土∶沙=1∶1)的盆钵中,每盆25粒。40d后选生长较为一致的植株进行移栽,然后用灌根法接种浓度为108cfu·mL-1的拮抗菌5mL·株-1(设不接病菌为空白对照,清水为阴性对照),48h后接种浓度为109cfu·mL-1青枯病菌5mL·株-1,每处理30株,从出现第1株病株开始,每天调查发病情况,进行病情指数统计。病情分级:0级为无症状;1级为1～2个叶片萎蔫;2级为全株1/3～1/2叶片萎蔫;3级为全株1/2～3/4叶片萎蔫;4级为全株3/4以上叶片萎蔫或死亡。防效(%)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100。1.6测定根结指数和根冠重量的测定取生长一致的2叶番茄移栽于混合土壤(菜园土∶沙=1∶1)中,用灌根法接种浓度为108cfu·mL-1的拮抗菌5mL·株-1(设不接线虫为空白对照,清水为阴性对照),然后钻孔接种根结线虫卵约500个·株-1,每处理3个重复,每个重复3株,7～8周后参照文献的方法调查根结指数和根冠重量,如空白对照出现根结或青枯病症,则认为试验无效。防效=[(对照组根结指数-处理组根结指数)/对照组根结指数]×100%。1.7接种细菌,接种根结线虫青枯病菌和根结线虫的接种量同1.5和1.6,设以下7种处理:①M2:二叶期单独接种线虫;②M2+R:二叶期接种线虫+30d后接种细菌;③M4:四叶期单独接种线虫;④M4+R:四叶期接种线虫+15d后接种细菌;⑤MR:二叶期后30d,同时接种细菌和线虫;⑥R+M:二叶期后30d接种细菌+10d后接种根结线虫;⑦R:二叶期后30d单独接种细菌;⑧设不接种病原为阴性对照(CK)。每处理3个重复,每个重复8株。线虫病情调查:接种细菌前,每个重复取4株扣盆法调查其根结线虫发病率;接种细菌后,于病情稳定时每个重复取剩余4株进行调查。青枯病病情调查:于接种细菌后每日观察记录,病情分级同1.5。1.8发病情况调查番茄种子经拮抗菌浸种处理12h后,播于混配自然土(菜园土∶沙=1∶1)中,待长至二叶期时,移栽入含根结线虫的病土中,每处理42株,20d后再次以灌根法接种拮抗菌(接种浓度108cfu·mL-1),2d后接种浓度为2×107cfu·mL-1的青枯病菌,从出现第1株病株开始记录每天的发病情况,并统计病情指数。病株枯萎后扣盆调查根结线虫发病情况。1.9序列原位排列按文献的方法对防治效果较好的菌株进行传统鉴定;测定部分菌株的16SrDNA序列,所获序列经DNAman软件编辑,去除末端的不完整碱基片段,对序列同源性进行初步分析;再利用ClustalW软件进行序列对位排列。ClustalW软件参数设置为:slow/accurate,gapopeningpenalty:15.00,gapextensionpenalty:6.66,delaydivergentsequences:30%,DNAtransitionsweight:0.50,negativematrix:off,DNAweightmatrix:IUB,序列以phylip格式输出。输出文件经Mega3.0转化成meg格式后,基于Kimura双参数模型计算遗传距离,使用Neighbor-joining法进行参数估计,由此生成进化树文件。1.10数据分析利用生物统计软件DPS(V6.55)对试验数据进行分析,统计分析方法采用Duncan氏新复极差测验。2结果与分析2.1筛选n6、en9、en5和sb1的活性对分离菌株抑制番茄青枯病菌的能力进行测定,获得13株具有不同程度抑制活性的菌株,其中菌株EN1、EN6、EN9、EN15、SB1和SB2的抑制活性较高,抑菌圈大小达19.6～26.3mm(表1);除菌株EN16和SW1外,其他菌株还能同时抑制多种土传病原真菌的生长,尤其是菌株EN5、EN6、EN9和EN15,均表现出较强的拮抗作用。这些拮抗菌株的广谱抗菌活性,更利于它们后期的生防应用。2.2以病情指数为依据的不同防效情况试验分4组测定13个菌株对番茄青枯病温室防效的变化情况。结果显示(图1),拮抗细菌的防效变化大致可以归为3类:第1类菌株能持续作用,防效较为稳定,虽然后期有所下降,但仍能保持在较高的水平,如菌株EN1、EN5、EN15、SB1、EN01和EN16;第2类菌株在对照病情指数低时具有较高的防效,但随着病情的发展,防效迅速下降,如菌株EN9;第3类菌株的起始防效不高,且呈持续下降的趋势,或虽有所上升,但仍处于较低水平,如菌株EN6、SB2、SV3等。综合各时段的防治效果来看,第1类菌株的平均防效均高于40%,其中以EN5、EN15、EN01和EN16的防效较高,平均防效分别为70.82%、89.54%、85.38%和78.81%。与2.1结果相比较,拮抗菌的抑菌能力强弱与温室防效高低并不呈正相关,这说明分离的拮抗菌株可能还存在抑菌作用之外的其他防病机理。2.3对根结线虫的防效在第1组试验结果(表2)中,菌株EN15、EN16、SB2和SW1处理的番茄植株生长较快,其根系中根结较小,侧根生长茂盛,根系受损程度远小于对照,它们对番茄根结线虫的防效在40%左右。第2组试验结果(表2)中,菌株EN5、EN6和EN9也能缓解根结线虫病的矮化现象,对根结线虫病的防效在40%～50%之间;从两组试验可以看出,经防病效果好的菌株处理后,番茄的根结指数较低,植株趋于正常生长,根冠重显著高于清水对照和培养基对照,地上部的差别尤为明显;而经防效不佳的菌株处理后,番茄生长情况与清水对照或培养基对照差别不大。因此,植株地上部生长情况的变化既是根结线虫侵染的主要表征之一,也可作为衡量菌株防效的一个参考指标。2.4接种根结线虫的培养接种试验结果表明(表3),两种病原在番茄上存在复合侵染关系,根结线虫的介入加重了番茄青枯病的发病程度。根结线虫接种越早,青枯病发病的潜伏期越短,发病程度也越严重。青枯病病情调查结果显示,接种根结线虫的处理均比单独接种青枯菌株的处理发病严重,其中以处理2(二叶期接种线虫,30d后接种青枯病菌)发病间隔期最短,病症最为严重。另一方面,青枯病菌也对根结线虫的侵染有一定的促进作用,从表3中可看出处理2的根结指数明显高于处理1。2.5根结线虫防治以2.4结果中处理2的方法测定EN5、EN15等7个菌株对青枯-根结复合侵染病害的防治效果(表4)。菌株EN5、SB2和SW1处理后的番茄根系中根结明显较小,有效减缓了根结线虫对番茄青枯病的加重危害,从而降低青枯病的发病率,也使植株的生长量保持较高水平。其中SW1施用后,根结线虫指数降至2.50,青枯病防效达62.39%,防治作用明显优于菌株EN5和SB2;而SB2对青枯病的防治效果并不理想(图1C),但其对根结线虫病的防治作用(表2)有效地提高了植株对青枯病的抗性,在复合病害的控制中也表现出一定的优势。2.6芽孢杆菌的结构鉴定综合以上筛选结果,对防病效果较好的菌株EN5、SB2和SW1进行了初步鉴定。培养形态观察和常规生理生化测定表明,3个菌株均是革兰氏阳性菌,菌体呈杆状,产芽孢,兼性厌氧,在7%NaCl和pH5.7中生长,接触酶、V.P反应阳性;淀粉水解反应、硝酸还原反应呈阳性,参照文献的芽孢杆菌鉴别特征表,初步鉴定3个菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。将菌株16SrDNA序列与GenBank中芽孢杆菌的相应序列进行比对,结果表明(图2),3个菌株与B.subtilis及枯草芽孢杆菌内生亚种位于同一分支,其中,SB2和SW1与B.subtilis同源性较高,共同构成一个小分支,而EN5与枯草芽孢杆菌中的内生亚种遗传距离较小。16SrDNA分析结果与常规生化鉴定的结果基本一致,因此,将3个菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。3生防菌株的筛选及联合控病作用的研究本试验分别从根围和根内分离到数量相当的菌株,从平板抑菌活性初筛结果看来,根内活性菌株的数量明显多于根围菌株,在番茄青枯病控病试验中,根内菌株的防效也比根围分离细菌的防效更高。研究表明,定殖于植物内部的细菌具有更为安全稳定的生存环境,有利于其更好地发挥功能。在本试验中,由根内分离的菌株是否也较易在植株体内稳定增殖并迁移,从而直接抑杀导管内大量繁殖的青枯病菌?在下一步试验中,将通过调查有效菌株的内生性和定殖力情况,深入分析番茄青枯病生物防治中菌株内生性与防治作用的相关性。在番茄根结线虫病的控制方面,情况则有所不同,根表细菌似表现出更好的防治作用。前人的研究表明,根际细菌主要通过改变根系的营养分泌情况达到其防病作用。本文分离的根表细菌是通过大量占据根表位点并参与根围生理生化代谢,改变根围的营养结构,从而形成不利于根结线虫生长的环境,有效控制根结线虫病,还是通过直接的抑杀作用实现生物控制?而根内细菌的生防机理又如何?这些问题均需要进一步的试验加以分析和验证。随着植物病理学研究的深入,人们已发现自然界中许多植物病害的发生并非仅由一种病原物引起,而往往是以一种病原为主,一种或两种其他病原参与作用形成的复合侵染,这种侵染造成的损失远甚于单一病原引起的损失。虽然早在20世纪50至70年代已经证实了复合侵染病害的存在,并明确了各病原的相互作用关系,但从这方面着手进行病害控制的研究却很少。而利用活性菌株控制青枯病菌与根结线虫复合侵染的研究还未见报道。本试验中,在利用生防菌株防治这类复合侵染病害时,通过盆栽试验从13株对青枯病或根结线虫病有不同防效的菌株中筛选得到3株对复合侵染病防效较好的菌株。从整个筛选结果来看,多数菌株只对其中的一种病原具有较好的防治作用,对两种病症都有控制作用的菌株只占少数。而在生物防治应用中仅靠单一菌株难以获得稳定持续的控病效果,对两种病原引起的复合病害尤是如此,因此,有必要对具有不同活性的菌株进行有机的结合以加强防治效果