21微生物的实验室培养1课件

1专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养2

了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。

一、课题目标：

掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：3课题背景微生物研究和应用的前提：如何获得纯净培养物？防止杂菌入侵，获得纯净的培养物①合适的营养和环境条件②确保其他微生物无法混入4复习：微生物的类群微生物原核类:真核类非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻个体微小、结构简单酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形虫等）病毒、类病毒、朊病毒◆微生物的共同特点：一、微生物基础知识5举例1：细菌1】、细菌的形态、细菌：单细胞不分枝

微小而透明，染料染色后显微镜可见6细胞壁：成分肽聚糖；细胞膜；拟核：无染色体、无核膜、无核仁质粒：小型环状DNA细胞器：只有核糖体2】、细菌的构造图1-3细菌的结构7细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）3】、细菌的繁殖4】、细菌的菌落*⑴定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。⑵特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。可以作为菌种鉴定的重要依据。8几种菌落及其形态9举例2：病毒1】、结构:由核酸和蛋白质构成。SARS病毒、禽流感病毒朊病毒（蛋白质病毒）10吸附注入合成释放组装2】、病毒的繁殖病毒的增殖一般可分五个阶段，即：吸附→注入核酸→合成核酸和蛋白质→组装→释放3】、病毒的营养方式：寄生11举例3：真菌酵母菌青霉菌——青霉素12一基础知识1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2.类型：按物理性质划分：按化学成分划分：按用途划分：（一）培养基13固体培养基液体培养基有无凝固剂琼脂分离鉴定工业生产（1）按物理性质划分：14单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.意义：1.定义：鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体※菌落15天然培养基合成培养基化学成分不恒定的天然有机物如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基化学成分完全了解的物质配制而成的培养基如：高氏1号培养基、查氏培养基。用于分类和鉴定（2）按化学成分划分：16基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基（3）按用途划分：17※几种选择培养基①加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌②不加氮源的无氮培养基分离固氮菌③不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物183.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源194.配制原则(1)目的明确：(2)营养全面、浓度适宜、比例恰当(3)适宜的pH值：有机碳源异养型：根据微生物的种类、培养目的选择原料自养型：不加碳源加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸（CO2碳源）生产科研微生物生长不可缺少的微量有机物如：维生素、氨基酸、碱基等(4)特殊营养：20※蛋白胨:动物蛋白初步消化的产物，富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。主要提供氮源和维生素。※牛肉膏：新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而成，含有多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。提供碳源、氮源、能源、磷酸盐和维生素。21（二）无菌技术防止外来杂菌的污染1.哪里需要无菌？2.如何控制无菌？无菌的意义：22（1）实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。1.无菌的范围23（1）消毒（2）灭菌概念较为温和理化方法杀死部分有害微生物(不包括芽孢和孢子)强烈的理化因素杀死所有的微生物包括芽孢和孢子常用方法①煮沸消毒法②巴氏消毒法③化学药剂消毒法④紫外线消毒法①灼烧灭菌法②干热灭菌③高压蒸汽灭菌适用对象操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿，培养基等2.无菌的方法24※芽孢：在某些细菌生长的一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或柱形的，抗逆性强的休眠体。※孢子：真菌所产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞，能直接发育成新个体。25接种室内空气、接种箱、超净工作台用紫外线照射30min紫外线消毒实验者的手臂、实验台等酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液化学药剂消毒牛奶等不宜高温消毒灭菌的70～75℃,30min；80℃,15min巴氏消毒日常食物、罐装食品100℃,5～6min煮沸消毒法适用范围条件方法（1）消毒2615～30min100kPa，121℃培养基、实验器材高压蒸汽灭菌1～2h干热灭菌箱（160℃～170℃）耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）干热灭菌烧红酒精灯火焰充分燃烧层灼烧接种的工具、试管口、瓶口灼烧灭菌灭菌时间所需条件适用对象灭菌方法灼烧灭菌干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅（2）灭菌27请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手思考28微生物实验室培养的基本操作程序1.器具的灭菌2.培养基的配制3.培养基的灭菌4.倒平板5.微生物接种6.恒温箱中培养7.菌种的保存291.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2.类型：按物理性质划分：（一）培养基30固体培养基液体培养基有无凝固剂琼脂分离鉴定工业生产（1）按物理性质划分：31接种室内空气、接种箱、超净工作台用紫外线照射30min紫外线消毒实验者的手臂、实验台等酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液化学药剂消毒牛奶等不宜高温消毒灭菌的70～75℃,30min；80℃,15min巴氏消毒日常食物、罐装食品100℃,5～6min煮沸消毒法适用范围条件方法（1）消毒3215～30min100kPa，121℃培养基、实验器材高压蒸汽灭菌1～2h干热灭菌箱（160℃～170℃）耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）干热灭菌烧红酒精灯火焰充分燃烧层灼烧接种的工具、试管口、瓶口灼烧灭菌灭菌时间所需条件适用对象灭菌方法灼烧灭菌干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅（2）灭菌33大肠杆菌的纯化培养：（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基二实验操作（二）纯化大肠杆菌341000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g1.计算：培养基用量依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂、搅拌→补水定容4.调pH、分装、封口：5.灭菌：6.倒平板：加棉塞、包牛皮纸、橡皮筋勒紧（一）制备培养基培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌35计算

称量

溶化

调节pH

灭菌

倒平板（一）制备培养基1.将培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。12342.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。3.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上皿盖。4.等待平板冷却凝固（约需5～

10min）。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。361.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。373.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：①防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染

②避免培养基中水分过快蒸发。答：最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。38无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。5.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？39单个或少数菌体1.定义：固体培养基上大量繁殖子细胞群体（肉眼可见）※菌落2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。（二）纯化大肠杆菌40单个细胞单个菌落（二）纯化大肠杆菌从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。何为分离纯化？如何纯化？接种常见方法平板划线法操作核心防止杂菌污染，保持培养物纯度如何分散成单个细胞？稀释涂布平板法斜面接种穿刺接种微生物群分散411.平板划线法：分区划线法连续划线法（1）概念与原理：聚集的菌群连续划线稀释分散单个细胞菌落生长繁殖42(2)“平板划线”实验操作43第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环灭菌接种环44（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？问题讨论杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者接种结束后杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞每次划线前杀死接种环上原有微生物取菌种前目的灼烧时期45（2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

答：以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。463个划线平板1个不划线平板（重复实验）（空白对照）（3）培养放入37℃恒温箱中培养12h～24h472.稀释涂布平板法①菌液的梯度稀释：②涂布平板操作：(1)概念与原理：聚集的微生物单个细胞菌液梯度稀释菌落涂布平板(2)操作：生长繁殖48①系列梯度稀释操作9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水注意：移液管需要经过灭菌；试管口和移液管离火焰1～2cm处。49②涂布平板操作：50(1)