人卵巢癌skov3ax耐药细胞株的建立

人卵巢癌skov3ax耐药细胞株的建立

目前，紫杉醇（tax）是一种重要的临床化疗药物。用于晚期胃癌患者的早期治疗。它在延长患者的非步长期和中位生存时间方面具有显著优势。作为一种抗凝药物（ddp）转移到服用囊肿的患者，缓解率可达15%48%。但许多卵巢癌患者最终死于化疗耐药,建立理想的卵巢癌耐药细胞模型是深入研究卵巢癌细胞多药耐药机制的前提。2005年,我们采用TAX300μg/(ml·次),作用2h,反复大剂量冲击用药,成功建立了人卵巢癌TAX耐药细胞株SKOV3/TAX。现报告如下。1材料和方法1.1mtt-pcr扩增卵巢癌细胞株SKOV3,RPMI1640培养基,10%胎牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml,0.125%胰酶,0.05%四甲基偶氮唑盐(MTT),二甲基亚砜,0.1%TritonX-100,TrisHCl(pH7.6),0.55mmol/LNaCl,10mmol/LKCl等。药品:TAX,DDP,拓朴替康(TPT),5-氟尿嘧啶(5-FU),CTX,甲氨蝶呤(MTX),长春新碱(VCR),足叶乙甙(VP-16)。1.2抗癫痫植物的建立和抗癫痫植物的检测1.2.1tax+ddp的制备方法将卵巢癌细胞SKOV3接种到含10%小牛血清RPMI1640培养基的培养瓶中,置37℃、5%CO2的培养箱中,细胞呈单层贴壁生长。根据公式[(60×D)/5000]×2×103mg/(kg·d),以临床用药量(D)换算成本实验细胞用药量,临床卵巢癌患者TAX+DDP常规月化疗方案TAX用药剂量为175mg/m2。以临床大剂量冲击疗法常用剂量的3倍为标准,用浓度为300μg/ml的TAX冲击2h后,换无药培养基,使细胞恢复正常,消化传代后进行下一次冲击,连续12次。培养8个月后最终获得TAX浓度为300μg/ml的细胞株,命名为SKOV3/TAX,该细胞已反复传代3个月以上。1.2.2细胞培养板培养用0.25%的胰酶消化制成细胞悬液后,以1×104/ml接种在24孔细胞培养板中,每孔1ml,置37℃,5%CO2温箱中培养24h,从次日起,每天计数3孔细胞,取均值,连续7d。绘制细胞生长增殖曲线,按Patterson公式计算细胞在对数生长期的TD。1.2.3细胞形态结构观察取对数生长期的细胞,以5×104/ml浓度接种于6孔板,培养过夜,待细胞爬片后,进行Giemsa染色,观察细胞形态结构。取对数生长期的亲代细胞SKOV3和耐药细胞SKOV3/TAX,在透射电镜下观察细胞超微结构。1.2.4秋水仙碱的体外分离和测定向呈对数生长细胞的培养液中加入4μg/ml的秋水仙碱,终浓度为0.05μg/ml,作用4h,低渗处理30min,收获细胞,固定,Giemsa染色,封片油镜下观察、照像。1.2.5重组培养基的制备取对数生长期的SKOV3和SKOV3/TAX细胞,浓度为5×104/ml,以每孔200μl接种于96孔板,CO2培养,弃培养基,按10倍浓度梯度分别注入含TAX、TPT、DDP、5-FU、Vp-16、VCR、CTX、MTX培养48h,每孔设5个复孔。每孔加MTT(5mg/ml)20μl,用自动酶标仪测620nm波长各孔吸光度OD值,对照孔为不含血清的RPMI1640培养基。计算细胞存活率(实验孔OD值/对照孔OD值×100%),以浓度—存活曲线作回归方程,求出半数致死量(IC50),计算RI。1.2.6dna含量和细胞周期的测定取对数生长期的亲代细胞和耐药细胞悬液,浓度1×106/ml,离心后用70%乙醇在-20℃下固定48h,离心弃上清,PBS洗1次,RNA酶消化,碘化丙啶(PI)染色5min,用流式细胞术(FCM)分析DNA含量和细胞周期。1.2.7细胞荧光强度的测定将5×104/ml浓度的细胞悬液加入终浓度5μg/ml的罗丹明中,置37℃温箱30min,离心,更新培养基,37℃温箱保温30min后再用RPMI1640培养基洗涤,用FCM测定细胞的荧光强度。1.3统计方法应用Stata4.0软件,对数据进行t检验。α=0.05。2结果2.13.skov3和tax的安装SKOV3/TAX细胞已反复传代3个月以上,耐药性稳定。其耐药谱见表1。2.2染色体核型分析亲本细胞呈短梭形,贴壁生长,有明显的接触抑制现象,细胞生长迅速;SKOV3/TAX经300μg/ml的TAX反复作用2h,形态基本正常。24h时可见大量细胞死亡,脱壁呈悬浮状。少数剩余细胞形态不规则,胞质有空泡形成和颗粒增多变粗,有的细胞伸出树枝状突起。这些细胞中的大部分逐渐成为凋亡细胞,最终死亡而被淘汰;另一部分逐渐成为耐药细胞株,耐药生长缓慢,体积明显变大,胞质空泡形成和颗粒增多。透射电镜下可见SKOV3/TAX细胞核大、形态不规则,染色体分布不均,胞质内富于核糖体和粗面内质网,线粒体丰富。染色体核型分析结果显示,两种细胞均为多倍体,其中SKOV3/TAX染色体众数为±60,属三亚倍体;SKOV3染色体众数为±92,属四倍体。2.3td和k-ltd生长增殖体外细胞生长增殖曲线显示SKOV3和SKOV3/TAX在6～7d达到峰值,TD分别为(24.38±3.01)、(35.13±4.21)h,SKOV3/TAX生长增殖明显减慢(P<0.01);G2/M明显高于亲本细胞,S期比例明显降低(P<0.05)。详见图1。2.4还对具体抗氧化药物的敏感性RI为10.57。除对TAX耐药外,还对VP-16、5-FU、CTX有明显交叉耐药,对DDP、TPT、VCR和MTX的敏感性相似。见表1。2.5p-gdp在skov3和tax细胞中的发现99.93%的SKOV3/TAX呈P-gp高表达,14.83%的SKOV3有P-gp表达,两者比较,P<0.05。3更符合典型的细胞多药耐药表型TAX是一种具有复杂二萜类化学结构植树物来源的抗肿瘤药物,其作用机理独特:可促进微管聚合并抑制其解聚,使细胞阻断在G2/M期,对包括卵巢癌在内的恶性肿瘤有突出的疗效,但随之产生的耐药现象日益严重,最终导致化疗失败。目前,对TAX耐药的研究多采用浓度梯度递增法在体外诱导耐药细胞株,但却忽视了对耐药产生较缓慢、耐药性较低、可能产生不同耐药机制细胞的研究。为解决这些问题,我们采用大剂量TAX,反复冲击用药,经过8个月的诱导培养,成功建立SKOV3/TAX。其RI为10.57,且除对TAX耐药外还对CTX、5-FU、VP-16有明显的交叉耐药,对DDP、VCR、TPT、MTX敏感性相似。表明我们所建立的SKOV3/TAX符合典型的细胞多药耐药表型。本实验表明:与亲本细胞相比,SKOV3/TAX生长缓慢、细胞异形性明显、分裂指数降低并有巨细胞形成,表明肿瘤细胞受到损伤使细胞分裂减少。透射电镜下观察可见SKOV3/TAX细胞核大形态不规则,染色体分布不均,胞质内富于核糖体和粗面内质网,线粒体丰富。肿瘤细胞产生多药耐药的机制涉及多种因素,并可同时发挥作用,但其中以多药耐药基因的过度表达最为重要。正常卵巢和良性卵巢肿瘤多药耐药基因(MDR1)表达较低或不表达,接受过TAX治疗的卵巢癌患者MDR1表达较高,产生的P-gp可使化疗药物从癌细胞内泵出细胞外,从而使药物在细胞内蓄积浓度下降,药物对细胞毒性降低,导致化疗失败。我们用FCM检测到SKOV3/TAX内药物聚集量明显低于亲本细胞,由于SKOV3/TAX为获得性多药耐药细胞株,即对药物敏感的SKOV3接触到TAX后,敏感细胞逐渐死亡,