南瓜多糖口服液和颗粒剂对糖尿病大鼠降糖作用的研究

南瓜多糖口服液和颗粒剂对糖尿病大鼠降糖作用的研究

0糖尿病大鼠血糖的变化糖尿病（m）是一种由胰岛素绝对或相对分泌不足引起的内部疾病，主要表现为糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱。临床表现为“三分之三”。换句话说，食物、饮料和尿液的增加会增加，体重会减轻。糖尿病会导致各种并发症，严重危害人类健康，发病率也在逐渐上升。糖尿病是一种终身疾病，无法治愈，需要长期治疗。目前，糖尿病的临床治疗药物主要是胰岛素、丙基瓜和双胺类药物。这些药物的副作用包括：例如，低血糖症、长期使用和并发症。因此，高效低毒药物的开发具有很强的市场前景。南瓜为葫芦科植物.南瓜的果实,富含多种氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、淀粉、纤维素及微量元素等,具有较高的食用价值.南瓜具有降血糖、降血脂、防治癌症、解毒和保肝肾等功效.南瓜多糖(pumpkinpolysaccharide,PP)是南瓜中主要的降糖活性成分.实验表明,南瓜多糖具有较好的降糖作用.将南瓜多糖制备成有效成份稳定、质量标准统一、口感好、便于服用携带、便于储存的口服液和颗粒剂,为南瓜多糖的进一步开发利用提供理论依据.链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是一种DNA烷基化试剂,具有升血糖的副作用,对实验动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用,能诱发动物产生糖尿病.本文通过建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型,观察南瓜多糖口服液和颗粒剂对糖尿病大鼠血糖的影响.1材料和方法1.1试剂及试剂厂成熟南瓜(市场上购买);链脲佐菌素(上海华蓝化学科技有限公司);盐酸二甲双胍肠溶片(贵州天安药业股份有限公司).葡萄糖(分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司);苯酚(分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司);浓硫酸(分析纯,沈阳经济技术开发区试剂厂);无水乙醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司);甘露醇(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);可溶性淀粉(分析纯,天津市博迪化工有限公司);羧甲基纤维素钠(分析纯,沈阳化学试剂厂).1.2紫外/可见分光光度计RE52CS旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);UV-2550紫外/可见分光光度计(日本岛津仪器公司);FD-80真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);迈瑞BS-380全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司).1.3试验对象动物SD大鼠,雄性,体重170～200g,由沈阳市沈河区龙元经济动物养殖场提供,合格证号:SCXK(辽)2010-0001.1.4实验方法1.4.1南瓜多糖的制备将成熟的南瓜洗净,去表皮、籽、瓤后切成薄片.烘干粉碎后,加入3倍量的水,热水浸提两次,每次4h,过滤,合并滤液,将滤液浓缩至约原体积的1/3,加95%乙醇醇沉,低温过夜,离心得到沉淀,少量水复溶,加95%乙醇进行第二次醇沉,离心,冷冻干燥得到疏松多孔略带淡黄色的固体,即为南瓜多糖.1.4.2苯酚-硫酸法多糖含量的测定采用苯酚-硫酸(phenol-sulfuricacid)法.此法简单、显色稳定、灵敏度高、重现性好.因此应用苯酚-硫酸法测定南瓜多糖含量具有一定的参考价值.1.4.2.标准曲线的绘制精密称取烘干(105℃)至恒重的无水葡萄糖100mg于100mL容量瓶中,加水至刻度,分别精密量取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL于10mL容量瓶中,加水至刻度,各取2mL加入6%苯酚1.0mL及浓H2SO45.0mL,振荡摇匀,沸水浴中加热15min,冷却至室温后于490nm波长处测吸光度A,以2.0mL的水按同样显色操作为空白,以对照品溶液浓度为横坐标X,吸光度测定值为纵坐标Y,做标准曲线,得标准曲线方程为Y=0.012X+0.0684,r=0.9996,在10～50μg/mL范围内线性关系良好.1.4.2.2.方法研究(1)方法的精密度精密配制高、中、低三种浓度的样品溶液,按标准曲线项下方法操作测定吸光度,重复5次,计算日内、日间精密度均小于3%,表明本方法精密度良好.(2)重复试验精密配制已知浓度的样品溶液6份,按标准曲线项下方法操作测定吸光度,计算相对标准偏差为1.409%,表明本方法重复性较好.(3)方法的稳定性测定精密配制已知浓度的样品溶液,按标准曲线项下方法操作测定其吸光度,每隔30min测1次吸光度,一共测定6次,计算相对标准偏差为0.815%.表明样品溶液在3h内稳定.1.4.2.南瓜多糖含量测定精密称取南瓜多糖200mg置于100mL容量瓶中,加入20mL水超声溶解,然后加入80mL无水乙醇醇沉,超声1h,冷却至室温后过滤,残渣用80%乙醇洗涤2～3次,用少量沸水将滤渣洗入原容量瓶,加水定容到100mL.从上述溶液中精密量取2mL溶液定容至50mL,作为供试液.精密量取供试液2mL,按1.4.2.1方法操作,并按标准曲线计算南瓜多糖含量.测得的多糖含量为50%～60%.1.4.3南瓜多糖口服液口服液制备:羧甲基纤维素钠在热水和冷水中溶解度均较好,安全可靠,可作为食品的稳定剂、增稠剂.加入适量的羧甲基纤维素钠可明显提高南瓜多糖口服液的稳定性.精确称取羧甲基纤维素钠4g,加少量蒸馏水.待其自然膨胀溶解后,与南瓜多糖40g、山梨酸钾2g混合,加蒸馏水超声溶解,最后补水至1000mL,搅拌混匀,玻璃瓶灌装,高温灭菌,冷却即得南瓜多糖口服液.颗粒剂制备:南瓜多糖粘度大、吸湿性强,制粒困难,所以考虑加入填充剂.甘露醇溶解性好、抗湿性好但可压性差、价格稍贵;可溶性淀粉价格低廉、性质稳定但溶解度差.综合考虑采用混合辅料以便取长补短,共同做为填充剂,制备多糖颗粒剂.将南瓜多糖、甘露醇、可溶性淀粉研磨成细粉,过100目筛备用.精确称取南瓜多糖30g,甘露醇40g,可溶性淀粉30g,充分混匀,75%乙醇制软材,20目制粒,60℃干燥1h,整粒,筛除细粉,即得南瓜多糖颗粒.1.4.4山羊口服和紧缩剂的主要物质指标的测定1.4.4.1.测定腹泻主要品质指标的方法(1)南瓜多糖口服液中多糖含量的测定精密量取口服液10mL,溶于10mL蒸馏水中,超声溶解30min,过滤,作为储备液.精密量取储备液1mL置于10mL离心管中,加入5mL无水乙醇,摇匀,静置5min,4000r/min离心10min,倾去上层液体,沉淀用蒸馏水溶解并定容至50mL容量瓶中,作为供试液.精确吸取2mL供试液,按1.4.2.1方法操作,按照标准曲线计算南瓜多糖口服液中多糖的含量.GB47892-2010;大肠菌群的测定:GB47893-2010;致病菌的测定:SN/T1869-2007.1.4.4.2.粒剂主要物质指标的测定(1)南瓜多糖份粒剂中多糖含量的测定精确称取南瓜多糖颗粒500mg,溶于50mL蒸馏水中,超声溶解30min,过滤,作为储备液.精密量取储备液1mL置于10mL离心管中,加入5mL无水乙醇,摇匀,静置5min,4000r/min离心10min,倾去上层液体,沉淀用蒸馏水溶解并定容至50mL容量瓶中,作为供试液.精确吸取2mL供试液,按1.4.2.1方法操作,按照标准曲线计算南瓜多糖颗粒剂中多糖的含量.(2)溶解试验称取颗粒10g,加热水200mL,搅拌5min后观察颗粒溶解情况.(3)充填颗粒筛称取颗粒10g置于药筛内过筛,过筛时,保持水平状态过筛,左右往返边筛动边轻叩3min,不能通过1号筛(10目)和能通过5号筛(80目)的颗粒不得超过总颗粒质量的15%.(4)灰化过程中颗粒总灰的测定称取颗粒3g,置炽灼至恒重的坩埚中,称定重量,缓缓炽热,至完全炭化时,逐渐升高温度至500℃～600℃,使完全灰化并至恒重.根据残渣重量,计算颗粒的总灰分.(5)含水量%的测定称取颗粒2g置于干燥至恒重的称量瓶中,厚度不超过5mm,精密称定,打开瓶盖在105℃干燥5h,将瓶盖盖好,移置干燥器中,冷却30min,精密称定,再在上述温度干燥1h,冷却,称重,至连续两次称重的差异不超过5mg为止,两次干燥称重的差值与初始颗粒的重量比即为含水量.根据减失的重量,计算供试品中含水量(%),不得超过6%.1.4.5杏仁糖的降糖实验1.4.5.大鼠血糖等情况的模型建立大鼠适应性喂养1w后,禁食24h(禁食不禁水),连续两天腹腔注射链脲佐菌素55mg/kg.注射后2h喂以6%的糖水,72h后测空腹血糖值.把血糖值大于11.0mmol/L大鼠定为糖尿病大鼠.将50只糖尿病大鼠按血糖值随机分为5组,每组10只,分别为:模型对照组,阳性对照组,南瓜多糖组,南瓜多糖口服液组,南瓜多糖颗粒剂组.模型对照组给予等体积的生理盐水,阳性对照组给予二甲双胍(剂量为280mg/kg),给药组分别给予南瓜多糖、南瓜多糖口服液,南瓜多糖颗粒剂(剂量为280mg/kg).造模成功后1w灌胃给药.每组灌胃给药21d,一日两次,每次2mL.每2d称体重一次,及时调整灌胃剂量.1.4.5.2、试验指标分别于第11、21d,给药后7h测定血糖值.每日观察动物体重、进食、饮水、尿量、皮毛等情况.1.4.5.3-血糖法采用眼眶取血,37℃恒温放置30min,4000r/min离心20min,取上层血清,采用全自动生化分析仪测定血糖值.1.4.5.4-统计方法采用PASWStatistics18.0统计软件进行T检验.各组数据以(x±s)表示.P<0.05为差异有统计学意义.2结果与分析2.1口服的主要物质指标2.1.1感觉指标色泽:淡黄色,均匀一致;气味:具有南瓜特有的芳香;滋味:入口微甜,无异味;组织状态:半透明,无杂质.2.1.2物理和化学指标南瓜多糖含量≥32.20mg/mL;pH值5.0～6.0;重金属含量及农药残留均符合国家卫生标准.2.1.3微生物指数细菌总数≤100CFU/mL;大肠菌群≤40CFU/mL;致病菌:不得检出.2.2颗粒、灰、颗粒、白砂糖的含量测定,提出南瓜多糖颗粒剂中南瓜多糖的含量:18.79%.溶化性试验:随着搅拌,颗粒逐渐崩解.溶解时间1min左右,最终得到澄清透明的淡黄色溶液.粒度试验:不能通过1号筛(10目)和能通过5号筛(80目)的颗粒质量为0.873g,占总颗粒重的8.73%,符合要求.灰分测定试验:最终得到残渣质量为0.096g,颗粒的总灰分为3.2%,符合要求.水分测定试验:两次干燥称重的差值为0.048g,含水量为2.4%,符合要求.2.33.实行《决定》第5款第5款第5.55.实行《决定》第5款第5.5.5.5.5.5.5.5%逐步形成给药21d后,模型对照组的血糖仍处于较高的水平.给药后与给药前相比血糖下降明显(P<0.05);给药组中,南瓜多糖组、口服液组和颗粒剂组降糖率分别为43.53%、44.97%和46.20%.南瓜多糖组与制剂组相比无显著差异.实验表明,辅料对南瓜多糖的降糖作用影响较小.南瓜多糖、南瓜多糖口服液和南瓜多糖颗粒剂对糖尿病大鼠具有降糖作用.结果见表1.2.4糖尿病体征糖尿病大鼠一般表现为多饮、多食、多尿、体重下降、体毛松散无光泽.给药21d后,给药组精神逐渐好转,进食、饮水、尿量均减少、体重较造模初期有所上升.而模型对照组的糖尿病体征没有明显好转.3南瓜多糖降糖作用概述南瓜资源丰富且价廉,具有极高的营养价值.南瓜多糖具有明显的降糖作用.因此,具有良好的发展前景.然而,目前进行的研究大多是南瓜多糖的活性研究,已上市的南瓜产品多是南瓜粉、南瓜籽、南瓜汁等粗加工类保健食品,南瓜多糖剂型的研究相对较少,更没有上市的剂型.本文将南瓜中的降糖活性成分南瓜多糖提取出来并将其制成单一成分的口服液与颗粒剂,具有口感好、无不良气味、易于服用、携带方便、质量稳定、毒副作用小等优点,提高了患者的依从性.药理实验结果表明南瓜多糖口服液和颗粒剂对STZ糖尿病大鼠具有明显的降糖作用,为南瓜多糖的进一步临床应用提供指导,并为预防及治疗糖尿病提供了可靠的途径.STZ是一种常用的诱导糖尿病模型的药物.其易见光分解,因此需避光操作.pH为4.2～4.5时,STZ活性最好.本文所用柠檬酸缓冲液pH值为4.31.为了提高造模成功率,本文采取多次小剂量腹腔注射STZ的方法,最终可形成稳定持久的糖尿病.多次小剂量注射STZ与一次性大剂量注射STZ相比,不仅可以提高造模成功率,还可以明显地降低实验动物的死亡率.在分离血清的过程中,比较容易出现溶血现象.溶血对血液标本的