人结肠癌奥沙利铂耐药细胞hc116l-ohp耐药机制的初步研究

人结肠癌奥沙利铂耐药细胞hc116l-ohp耐药机制的初步研究

奥萨利铂（oxaliplati，l-hp）是一种铂类化疗药物，其家族成员包括顺铂（cipslati，dp）和卡铂。研究发现,L-OHP的临床应用范围较广,已经成为临床治疗结肠癌的一线药物。L-OHP在临床广泛应用的同时也带来了化疗药物产生耐药的严重问题。因此,研究肿瘤细胞发生化疗耐药的机制具有十分重要的意义。本研究以L-OHP为诱导剂,通过逐步增加作用于亲代细胞的药物浓度与间断大剂量药物诱导建立人结肠癌L-OHP耐药细胞模型,并与亲代细胞对比,进行生物学特性及其机制的初步探讨。1材料和方法1.1药物、试剂和trizel试剂RPMI1640培养液和小牛血清均购自美国Gibco公司;MTT购自美国Sigma公司;5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)购自上海旭东海普药业有限公司;7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydrol-camptothecin,HCPT)购自深圳万乐药业有限公司;DDP购自齐鲁制药有限公司;L-OHP购自江苏恒瑞医药股份有限公司;电化学发光试剂购自上海闪晶分子生物科技有限公司;兔抗人P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白1(multidrugresistanec-associatedprotein1,MRP1)、肺耐药蛋白(lungresistanceprotein,LRP)、谷胱甘肽S转移酶(glutathioneS-transferase,GST)单克隆抗体(一抗)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(一抗)及辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的羊抗兔或大鼠抗小鼠多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司;TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;Agilent人全基因4*44K芯片购自美国AgilentTechnologies公司。1.2细胞和细胞培养1.4细胞存活率和耐药个数分别取对数生长期的HCT116、HCT116/L-OHP、脱离含L-OHP培养液1周的HCT116/L-OHP及–196℃冻存3个月后复苏的HCT116/L-OHP细胞,调整细胞密度至1×105个/mL,接种于96孔细胞培养板中,1×104个/孔。背景组加入不含细胞的等体积培养液,空白对照组加入不含L-OHP的培养液,实验组分别加入含500、250、125、62.5、31.25和15.625μg/mL的L-OHP培养液,100μL/孔,细胞继续培养24h;加入MTT(5mg/mL)溶液20μL/孔,继续培育4h;弃培养上清液,加入DMSO150μL/孔,充分振荡后上酶联免疫检测仪检测波长为570nm处各孔的吸光度(D)值。以背景组平均值调零,按以下公式计算实验组细胞的存活率:细胞存活率=(实验组平均D值-背景组平均D值)/(空白对照组平均D值-背景组平均D值)×100%;按以下公式计算耐药倍数(resistancefold,RF):RF=耐药细胞株的IC50值/亲本细胞株的IC50值。每个浓度设4个重复孔,实验重复3次。1.5细胞生长曲线分别取对数生长期的HCT116和HCT116/L-OHP细胞,调整细胞密度为5×104个/mL,接种到6孔培养板中,3mL/孔;细胞培养1~7d,用细胞计数板每天计数3个孔的细胞数,取平均值,绘制细胞生长曲线。按Patterson公式计算细胞群体倍增时间(doublingtime,TD):TD=T×log2/(logNt-logNo),No指初始细胞数,Nt指终末细胞数,T指Nt-No时间。实验重复3次。1.6细胞培养和mtt检测分别取对数生长期的HCT116和HCT116/L-OHP细胞,调整细胞密度为1×105个/mL,细胞接种于96孔细胞培养板中,1×104个/孔,分别加入不同质量浓度的5-FU(160、80、40、20、10和5μg/mL)、DDP(640、320、160、80、40和20μg/mL)和HCPT(160、80、40、20、10和5μg/mL),细胞培养24h。按1.4节的方法进行MTT检测,并进行IC50值和RF值的计算。各药物各浓度分别设4个复孔,实验重复3次。1.7hct116与hct116/l-ohp细胞的组织学检测在光学显微镜下观察贴壁生长的HCT116与HCT116/L-OHP细胞的基本形态学变化;收集HCT116与HCT116/L-OHP细胞,用2.5%戊二醛溶液4℃固定2h,再用2%四氧化锇溶液4℃固定30min,梯度丙酮溶液脱水、环氧树脂包埋,进行70nm厚度的切片,用醋酸铀染色,在透射电子显微镜下观察细胞的形态学变化。1.8表达蛋白表达水平检测分别取5×105个HCT116和HCT116/L-OHP细胞接种于100mL培养瓶中,收集培养48h后的细胞,用细胞裂解液提取细胞总蛋白,应用Brandford法测定总蛋白浓度。取20μg/孔总蛋白进行6%SDS,将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。室温下用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭lh,分别加入l:1000稀释的兔抗人P-gp、MRP1、LRP、GST一抗和1:800稀释的抗β-actin一抗,室温培育1.5h;TBST液洗膜3次,10min/次;加入l:5000稀释的HRP标记的二抗,室温培育1.5h;TBST液洗膜4次,10min/次;加化学发光试剂显影和定影,用UVP凝胶图像处理系统扫描胶片,应用Labworks4.6软件分析目的条带的灰度值,以目的蛋白条带的灰度值与β-actin蛋白条带的灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。1.9芯片扫描和标准化处理分别取5×105个HCT116和HCT116/L-OHP细胞,接种于100mL培养瓶中,收集培养48h后的细胞。用TRIzol试剂抽提细胞总RNA,由上海伯豪生物技术有限公司应用Agilent人全基因4*44K芯片进行检测和分析。实验采用Agilent放大标记方法,通过65℃、17h的探针滚动杂交,室温洗片,采用Agilent扫描仪进行芯片扫描,应用AgilentFeatureExtraction软件读取数据,扫描分辨率为5µm,光电倍增管(photoelectricmultiplicationtube,PMT)扫描强度为100%(高强度)和10%(低强度),最后采用FeatureExtration软件进行标准化处理分析。检测结果主要参考美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)数据库中的PubMed、OMIM和OMIA等收载的文献,通过京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)鉴别通路改变情况,将有差异的基因进行基因芯片显著性分析(significanceanalysisofmicroarrays,SAM),通过KEGG绘制通路,并统计分析结果。1.10统计方法2结果2.1种过滤材料作用hct116细胞的ic50值历时9个月最终获得了生长良好的、能耐受19.2µg/mLL-OHP的耐药细胞HCT116/L-OHP,HCT116/L-OHP细胞可在含1.6µg/mLL-OHP的培养液中维持培养。MTT法检测结果显示,L-OHP作用HCT116细胞的IC50值(14.73µg/mL)明显低于作用HCT116/L-OHP细胞的IC50值(250.38μg/mL),差异有统计学意义(P<0.01),RF为17.00;脱离L-OHP培养1周后,L-OHP作用HCT116/L-OHP细胞的IC50值(238.68μg/mL)仍明显高于HCT116细胞(P<0.01),RF为16.20,与撤药前比较,RF保持在95.32%以上;L-OHP作用经3个月冻存后复苏的HCT116/L-OHP细胞的IC50值(186.84μg/mL)仍明显高于HCT116细胞(P<0.01),RF为12.68,与撤药前RF无明显差异(P>0.05),耐药性保持不变且细胞仍能稳定生长和增殖。见表1。2.2耐药细胞的td细胞生长曲线显示(图1),HCT116细胞的增殖速度比HCT116/L-OHP细胞快,2种细胞的群体TD分别为42.25和63.69h,耐药细胞群体TD是亲代细胞的1.51倍。2.3hct116/l-ohp细胞的细胞信号通路表达本研究诱导获得的HCT116/L-OHP细胞不仅对L-OHP耐药,而且对5-FU、DDP和HCPT均产生不同程度的交叉耐药特性,对5-FU、DDP和HCPT的RF分别为2.29、4.24和2.10倍(表2)。2.4显微镜下观察细胞的形态学变化光学显微镜(×250)下观察发现,HCT116细胞呈单层排列,细胞大小相同,多为梭形,细胞贴壁生长,轮廓清晰,细胞间结构紧密;HCT116/L-OHP细胞同样呈单层排列,细胞大小不一,体积增大,形状不规则,细胞崩解,细胞核碎裂、固缩。透射电子显微镜下观察发现,HCT116细胞呈长梭形,细胞生长旺盛,细胞核较大,约占3/4,细胞间连接紧密,细胞表面有微绒毛;HCT116/L-OHP细胞体积变大,梭形变短,形状多样,细胞内有空泡,有双细胞核,细胞核扭曲,核仁凝聚,核大小不一,细胞表面微绒毛减少。见图2。2.5HCT116/L-OHP细胞中P-gp、LRP和GST蛋白表达上调蛋白质印迹法检测结果显示,HCT116/L-OHP细胞中耐药蛋白P-gp、LRP和GST的相对表达量高于HCT116细胞,差异有统计学意义(P<0.01),MRP1蛋白的相对表达量在二者间无明显差异(P=0.71)。见表3和图3。2.6HCT116/L-OHP细胞信号通路表达上调基因芯片检测结果显示,与HCT116细胞比较,HCT116/L-OHP细胞中有9条信号通路基因表达上调,分别为:细胞周期,p53,小细胞肺癌,结直肠癌,慢性髓细胞白血病,神经胶质瘤,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解,氨酰-tRNA合成和DNA聚合酶(P<0.05)。其中,细胞周期通路上调最明显,p53信号通路居次,推测HCT116/L-OHP具有多药耐药性可能与此2条通路的改变有关。见表4。3耐药蛋白及耐药机制本研究通过2种方法混合使用(先以药物浓HCT116/L-OHP细胞对L-OHP的RF为17.00倍;在脱离L-OHP作用1周后,HCT116/L-OHP细胞对L-OHP的RF仍保持在95%左右,有较为稳定的耐药性;HCT116/L-OHP细胞冻存3个月经复苏后细胞仍能稳定生长和增殖,其对L-OHP的RF为12.68倍。另外,对于5-FU、DDP和HCPT等结构及作用机制不同的抗癌药也产生了不同程度的耐药,具有多药耐药特征,是研究L-OHP耐药机制及筛选逆转剂理想的多药耐药细胞模型。度递增持续作用,有一定耐药性后再以大剂量药物间歇诱导),历经9个月得到了稳定的人结肠癌L-OHP耐药细胞模型HCT116/L-OHP。本研究发现,HCT116/L-OHP细胞大小不一,细胞体积增大,形态不规则,细胞崩解,细胞核碎裂、固缩;透射电子显微镜下观察发现,HCT116/L-OHP细胞体积变大,梭形变短,形状多样,细胞内有空泡,有双细胞核,细胞核扭曲且大小不一,核仁凝聚,细胞表面微绒毛减少。细胞核的变化是反映细胞分化程度的重要标志之一,表明本研究诱导的耐药细胞株分化程度较低;细胞表面微绒毛变少,细胞的表面积减小,表明耐药细胞的代谢和分裂活动减弱。本研究结果显示,HCT116/L-OHP细胞中耐药蛋白P-gp、LRP和GST的表达上调,这3种蛋白的高表达均与肿瘤耐药发生相关。P-gp是目前研究较深入的ABC蛋白成员之一,P-gp高表达是产生多药耐药的主要机制,P-gp可以与抗肿瘤药物及疏水亲脂性化合物结合,通过ATP水解供能,逆浓度梯度将药物泵出细胞外,导致细胞内药物浓度降低而产生耐药。LRP介导的多药耐药与细胞核、细胞质运输有关,可以控制药物从细胞核向细胞质转运,一方面可以阻止以细胞核为靶点的药物(如DDP和烷化剂等)通过细胞核孔进入细胞核,起到中间关卡的作用;另一方面可通过囊泡转运和胞吐机制将细胞质内药物排出细胞外,降低药物的绝对浓度而产生耐药。GST对肿瘤耐药作用主要由其解毒功能引起,Hour等应用RT-PCR法检测了顺铂耐药的膀胱转移癌细胞中GST-π的表达,发现随着细胞耐药程度的增加,GST-π的阳性表达相应上调。以上耐药蛋白的高表达,可能是介导人结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP多药耐药发生的机制之一。本研究通过基因芯片检测发现,HCT116和HCT116/L-OHP细胞间的信号通路差异主要是细胞周期及p53信号通路,主要影响DNA损伤检查点(DNAdamagecheckpoints)的DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependedproteinkinase,DNA-PK)和毛细血管扩张性共济失调突变(ataxiatelangiectasiamutated,ATM)/Rad3相关蛋白(ATM-andRad3-relatedprotein,ATR)。DNA-PK参与了多细胞非同源末端连接(nonhomologousendjoining,NHEJ)过程,是参与DNA双链损伤修复的修复复合体的基本组成成分,能保护由于电离辐射所致双链DNA被破坏的细胞,所以它的特异性抑制剂作为放疗增敏剂倍受关注。本研究结果发现,HCT116/L-OHP细胞较HCT116细胞DNA-PK表达上调,笔者推测HCT116/L-OHP细胞的耐药性产生途径之一可能是DNA-PK的表达上调,增加了DNA修复能力,进而使细胞产生耐药性。ATR基因是在人类基因库中发现的,其序列与ATM[ATM与ATR均属于检查点特异性的DNA损伤感应因子磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)家族]和SpRad3类似,DNA损伤则激活ATR、Rad17-RFC和9-1-1复合物,ATR继而磷酸化激活检查点激酶1(checkpointkinase1,Chk1)。激活的Chk1继而磷酸化细胞分裂周期蛋白25A(celldivisioncycle25homologA,Cdc25A),导致细胞G1期阻滞,之后便是p53介导的G1/S期阻滞的维持过程,从而阻断细胞周期的行进。本研究结果表明,HCT116/L-OHP细胞较HCT116细胞ATR表达上调,可能导致细胞周期停滞,这与耐药细胞株生长增殖速度减慢一致,这种现象在其他耐药细胞中也有发生。p53信号通路中除上游基因ATR改变明显外,该通路中另一个关键基因小鼠双微体扩增基因(murinedoubleminute-2,MDM2)也有明显上调。MDM2是一种进化上保守的癌基因,当MDM2过度表达时,可阻断p53蛋白的转录激活,p53功能抑制或失活,导致细胞异常增殖,促进细胞癌变。另一方面,由于MDM2的活性表达,即使是低水平MDM2的表达,也会引起细胞成瘤性的增强。研究发现,MDM2基因在恶性肿瘤中有明显的扩增与表达。Abdel-Fattah等研究发现,MDM2蛋白在结直肠癌组织中高表达。MDM2蛋白在结直肠癌组织中的高表达,是结直肠癌发生的早期事件。本研究结果表明,HCT116/L-OHP细胞较HCT116细胞中MDM2表达上调,可能促进了耐药细胞的癌变程度,使恶性程度增高。本研究显示,人结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP与HCT116细胞相比,细胞周期与p53信号通路中有关键基因上调,主要是与DNA损伤修复关系密切的DNA-PK和ATR等基因,笔者推测可能与以L-OHP为耐药细胞诱导剂有关,因为L-OHP是通过抑制细胞DNA修复能力而发挥作用的,在L-OHP诱导细胞时,使DNA损伤加重,激活DNA-PK和A