糖尿病模型大鼠骨髓间充质干细胞定向迁移至胰腺组织的规律

糖尿病模型大鼠骨髓间充质干细胞定向迁移至胰腺组织的规律

0总结1动物分组及处理设计：完全随机的组设计。单位:唐山工人医院,华北煤炭医学院。材料:实验于2004-08/2006-03在唐山工人医院中心实验室,华北煤炭医学院动物中心完成。青年SD大鼠(雌30只,雄10只)购自华北煤炭医学院动物中心(动物级别:SPF/VAF;许可证号:SCXK2002-0003);链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司;L-DMEM、进口胎牛血清(FBS)及Percoll购自Hyclone公司;SPY(寡核苷酸探针粉,2004FD)购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;“C-肽”放射免疫分析试剂盒购于北京市福瑞生物工程公司;Laminin及CD44抗体购自北京中衫生物公司;荧光二抗购自北京舒伯伟生物公司;荧光显微镜(M510,CarlZeiss公司)。设计、实施、评估者:设计者为第一、三作者,实施者为第一作者,评估者为全体作者,经过正规培训。方法:大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化和鉴定:雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死,无菌条件下取出大鼠股骨,剪去股骨两端,用含体积分数为0.1FBS的L-DMEM培养液的注射器从股骨一端反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液,800g离心5min,PBS10mL重悬细胞,缓慢注入10mLPercoll(密度1.073g/mL)上,3000g离心30min,PBS洗2次,800g离心5min,以含体积分数为0.2FBS的L-DMEM重悬细胞,注入25cm2塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为0.05CO2培养箱中培养。24h后更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每隔48h换液。待细胞达到80%~90%融合时,用0.25%胰酶-0.03%EDTA消化,传代比例为1∶4,每25cm2塑料培养瓶重新接种2.5×105细胞,此为第1代,此后依此传代培养。骨髓间充质干细胞的鉴定:取1块6孔板,每孔内放置1片无菌盖玻片,每孔接种1×106L-1骨髓间充质干细胞悬液2mL,常规培养。至盖玻片上长满细胞,取出盖玻片,0.01mol磷酸盐缓冲液冲洗2遍,冷丙酮固定15min。按照试剂盒说明书进行Laminin和CD44蛋白免疫荧光组织化学染色。实验分组及处理:随机选取雌性SD大鼠30只,分3组,每组10只。骨髓间充质干细胞组:大鼠经尾静脉注射1×106L-1骨髓间充质干细胞0.2mL;生理盐水组:大鼠经尾静脉注射生理盐水0.2mL;糖尿病模型组:雌性SD大鼠,用血糖仪及血糖试纸(Roche公司,德国)检测各基础血糖值及体质量,计算大鼠总体质量,按65mg/kg计算所需链脲佐菌素(STZ)剂量,将其溶于柠檬酸钠缓冲液中(pH4.2),立即给大鼠腹腔注射STZ。用血糖仪及血糖试纸监测大鼠血糖,当血糖≥16.7mmol/L且稳定2d后经尾静脉注射1×106L-1骨髓间充质干细胞0.2mL。各组动物行尾静脉注射后常规饲养7d,随后全部大鼠经10%水合氯醛麻醉后,腹腔静脉取血,取胰腺组织。C-肽及胰腺组织Y染色体检测:各组大鼠麻醉后经腹主动脉取血,分离血清,放射免疫法检测C-肽;取胰腺组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片(6μm),原位杂交法检测雌性大鼠胰腺组织中Y染色体阳性细胞(荧光显微镜下以492nm激发光激发)。主要观察指标:(1)骨髓间充质干细胞鉴定。(2)各组大鼠血糖值。(3)大鼠胰腺组织石蜡切片中Y染色体标记物情况及血清C-肽值。统计学分析:由第一、二作者应用SPSS11.0统计软件对实验数据进行分析。求平均数,单因素方差分析,组间比较采用t检验。2结果2.1动物的数量分析2.2大鼠血浆内固定糖的变化用血糖仪检测尾静脉血(断尾取血)血糖值,结果显示:雌性大鼠腹腔注射链脲佐菌素后2d血糖水平开始迅速升高,4d后血糖值大于16.7mmol/L且稳定在21mmol/L左右,见图1。2.3骨髓间充质干细胞染色免疫荧光法检测体外培养的骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察,骨髓间充质干细胞呈抗Laminin染色阴性,抗CD44染色阳性。CD44阳性反应颗粒呈绿色荧光、胞浆表达,结果见图2。2.3尾静脉骨髓间充质干细胞c-肽与注射前比较,正常雌性大鼠尾静脉注射生理盐水后,血清中C-肽值没有明显变化(P>0.05);正常雌性大鼠及糖尿病大鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞后,血清中C-肽值分别为:(0.443±0.109)μg/L,(0.374±0.961)μg/L,注射前血清中C-肽值分别为:(0.398±0.094)μg/L,(0.263±0.011)μg/L。与注射前比较,血清中C-肽值呈显著升高趋势(P<0.05或P<0.01)。2.4大鼠胰腺组织y染色体标记物阳性反应原位杂交、荧光显微镜观察各组胰腺组织石蜡切片中Y染色体标记物SPY表达,结果显示:在荧光显微镜下,Y染色体标记物阳性反应呈黄绿色。正常雌性大鼠尾静脉注射生理盐水后,胰腺组织中未见黄绿荧光存在;尾静脉注射骨髓间充质干细胞后,正常雌性大鼠和雌性糖尿病大鼠胰腺组织中均可见黄绿荧光存在,且糖尿病大鼠胰腺组织中黄绿荧光强度较大、数量较多。结果见图3。3细胞间充质干细胞移植治疗糖尿病骨髓间充质干细胞是成体干细胞的一种,具有极强的自我更新能力及多向分化潜能。已有实验证实,胚胎干细胞和成体干细胞均可被诱导分化为胰岛素分泌细胞,但由于胚胎干细胞培养和建系比较困难,及免疫排斥等问题,限制了胚胎干细胞的发展。最新研究显示,骨髓移植后能促进受体糖尿病鼠胰腺组织增生,改善小鼠生存率。更有研究发现,骨髓间充质干细胞体外能横向分化为产生胰岛素的细胞,表达多种胰岛β细胞发育和功能相关的基因。骨髓间充质干细胞的表面标志物表现为非单一性。多数研究者将CD29、CD44、CD105、CD166、Vimentin等阳性和Laminin、α-SMA等阴性作为骨髓间充质干细胞的特征性标志物。本实验采用密度梯度离心结合贴壁培养的方法分离大鼠骨髓中骨髓间充质干细胞,经免疫荧光组织化学染色证实:分离获得的骨髓间充质干细胞呈抗Laminin阴性和抗CD44阳性。该结果表明:分离、纯化的雄性大鼠骨髓来源细胞是骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病需要解决以下几个问题:骨髓间充质干细胞移植给患者后定向迁移至胰腺组织的数量是否能满足治疗的需要;骨髓间充质干细胞在胰腺组织内存活的时间有多久;骨髓间充质干细胞能否分化为胰岛素生成细胞。Choi等利用绿色荧光蛋白转基因小鼠作为供者,将自体分离的骨髓细胞静脉注入由STZ诱导所致糖尿病小鼠体内,结果显示胰岛细胞呈增殖的趋势。Hess等和Mathew等均用实验证实骨髓源性干细胞能促进胰腺再生,在胰腺β细胞受损时,其相应部位出现绿色荧光蛋白标记的骨髓源性内皮细胞的聚集。另外,有学者认为骨髓间充质干细胞能够抑制成熟T细胞功能,可降低损伤组织的炎症反应,启动组织修复。本实验结果显示,将雄性大鼠来源的骨髓间充质干细胞经尾静脉注射给雌性大鼠,在雌性大鼠胰腺组织中出现了Y染色体标记细胞。实验结果表明,体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞可定向迁移至胰腺组织中。C-肽测定结果显示,移植骨髓间充质干细胞后正常大鼠和糖尿病模型大鼠血清中C-肽值均较移植前显著升高。C-肽和胰岛素以等分子数在胰岛细胞生成和释放,且不受外源性胰岛素影响,能较准确反映胰岛β细胞功能。本实验结果提示,移植后糖尿病大鼠胰岛功能有所恢复。然而迁移至胰腺组织的骨髓间充质干细胞是否长期存活尚待进一步证实。本实验还发现,将雄性大鼠来源的骨髓间充质干细胞移植给雌性糖尿病大鼠,可在其胰腺组织内检测到更多的Y染色体标记细胞(相对于正常雌性大鼠)。本实验结果提示,胰岛β细胞坏死后产生的相关分子事件可能是趋化骨髓间充质干细胞向胰腺局部损伤病灶迁移的因素之一,其相关细胞信号途径及分子作用网络亟待深入探讨。1型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病,其病理机制是胰岛素产生细胞的缺陷或缺乏,是影响人类健康的重大难治疾病之一,目前临床尚无根治的办法。相关研究表明,胰岛移植是治愈1型糖尿病最有希望的方法。但是由于胰岛来源匮乏,无法满足临床治疗的需求。因此定向诱导骨髓间充质干细胞,进而行自体移植治疗1型糖尿病成为临床研究的热点。骨髓间充质干细胞又称骨髓基质细胞,具有多向分化潜能,除可向中胚层来源细胞分化外,还可分化为内胚层和神经外胚层来源的细胞。许多实验室相继报道了骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,对其分化特性的了解也逐步加深。研究表明,骨髓间充质