临床分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制研究

临床分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制研究

铜绿假单胞菌（pae）是一种广泛分布于自然界和健康人的皮肤、肠道和呼吸道。在正常情况下，它不会感染人体的任何组织。然而，如果身体的免疫水平降低，严重伤口和医疗操作后，它可能会感染大多数人体的组织。临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染,常常危及患者的生命。亚胺培南(IMP)为碳青酶烯类药物,是一种新型的β-内酰胺类抗菌药物,其抗菌谱广,对革兰阴性和革兰阳性菌、需氧菌、厌氧菌皆有很强的抗菌活性。药物学研究发现,亚胺培南对大多数β-内酰胺酶高度稳定(含ESBLs、AmpC酶),与青霉素结合蛋白(PBPs)亲和力强,并能够有效渗透细菌外膜进入周质间隙,具杀菌活性强大等特点,被认为是目前控制临床感染性疾病最为有效的药物之一,但随着广泛使用和过度使用,其耐药性也逐渐增加。因此,我们分析了我院34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPAE)对常用抗菌药物的耐药特点,并从碳青酶烯酶、金属酶产生,膜微孔蛋白丢失以及细胞内主动外排泵表型特征3个方面,对其耐药机制进行了研究,现总结报道如下。1菌株鉴定及药敏试验方法1.1菌株来源与质控菌株34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于2005年1-12月我院住院患者临床分离的标本(包括痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等)。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922。1.2主要仪器设备与试剂Eppendorfcentrifuge5417R低温离心机,恒温金属浴(杭州大和),MJPeltierThermalCycler(MJResearch),Bio-Rad电泳仪,Bio-Rad凝胶成像系统,琼脂糖(英国Oxoid公司),100bpDNA梯带标志物(大连宝生物),6×加样(loading)缓冲液(北京天为时代),氰氯苯腙(CCCP)终浓度5mg/L(Sigma),IMPEtest试条(0.002~32μg/ml)(瑞典ABBiodisk)M-H培养基(杭州天和),头孢哌酮/舒巴坦药敏纸片(英国Oxoid公司)。1.3菌株鉴定及药敏试验方法所有菌株均以BDPhoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种,必要时采用ATB或传统生化方法补充鉴定。药敏试验采用BDPhoeni×100配套药敏试验复合板,包括阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、四环素、复方新诺明共16种抗菌药物,头孢哌酮/舒巴坦采用K-B法。模板DNA提取,采用蛋白酶K消化法。1.4基因扩增oprD2基因热循环参数为93℃预变性3min→93℃30s→55℃30s→72℃60s,最后一个72℃延伸5min,共循环35周期。其余基因热循环参数为:93℃预变性3min→93℃60s→55℃60s→72℃60s,最后一个72℃延伸5min,共循环35周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。应用PCR方法,引物序列见表1。1.5结果判断取10μl扩增产物与2μl6×上样缓冲液混匀,点样于1.5%琼脂糖凝胶,在100V电压电泳30min,出现目的条带即为检测基因阳性,用凝胶成像系统观察并照相。1.6CCCP对主动外排泵表型特征的影响配制水解酪蛋白(M-H)琼脂和含CCCP(终浓度5mg/L,该浓度对外排泵有较好抑制作用,而对细菌生长无影响)的M-H琼脂平皿,挑取2~3个过夜培养的菌落,用生理盐水调至0.5麦氏单位,按照K-B法标准操作程序涂布菌悬液和贴Etest试条,放35℃培养24h,观察CCCP对IMP的MIC的逆转作用。当存在CCCP时IMP的MIC比缺乏时相应的MIC下降至原值的1/4,提示主动外排机制存在。2ccp存在对imp体外抗菌活性的影响2.1耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特点IMPRPAE除对阿米卡星100%敏感、对哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦较敏感,敏感率48%~55%;对其余β-内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素、磺胺类抗菌药物耐药严重,结果见表2。2.2耐药基因检测结果34株IMPRPAE中,检测到IMP阳性6株,阳性率17.6%,oprD2基因缺失1株,阳性率2.9%,其余耐药基因(VIM、GIM、SPM、OXA-10、GES)未检出。耐药基因电泳结果见图1、2。2.3CCCP存在与否对IMP体外抗菌活性的影响34株IMPRPAE中,CCCP存在使IMPMIC下降至4个浓度梯度的菌株有4株,占11.8%;下降至3个浓度梯度的菌株有4株,占11.8%;下降至2个浓度梯度的菌株有5株,占14.7%;其余的菌株在CCCP存在与否IMP的MIC值无变化,占61.7%。提示IMPRPAE对IMP主动外排的耐药机制占11.8%。3碳青酶烯类抗菌药物的耐药机制近10多年来,由于广谱头孢菌素及碳青酶烯类抗菌药物的广泛应用,细菌耐药率有增长趋势,特别是多重耐药和IMPRPAE是临床抗感染治疗的难点之一,倍受国内外学者关注。我院2005年1-12月分离的34株IMPRPAE除对阿米卡星敏感(敏感率100%)外,哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦对PAE有较强的抗菌活性,敏感率48%~54%;三代、四代头孢菌素、氨曲南、喹诺酮类等抗菌药物抗菌活性差,敏感率为3%~29%。对美罗培南敏感的有29%,提示PAE对亚胺培南和美罗培南的耐药机理不尽相同。34株IMPRPAE对氯霉素、复方新诺明、四环素全部耐药。因此,应重视和加强细菌耐药监测,合理应用和优先选用低耐药可能性的抗菌药物,将有助于控制细菌耐药,避免IMPRPAE引起医院感染流行。铜绿假单胞菌因其固有和获得性耐药,对IMP的耐药机制比较复杂,通常包括产酶、膜孔蛋白丢失、泵出机制、生物膜形成、青霉素结合蛋白改变等多种机制。碳青酶烯酶是能够明显水解碳青酶烯类抗菌药物的一类β-内酰胺酶,它包括Ambler分子分类为A、B、D类3类酶,其中B类为金属酶,属Bush分类中的3组,是PAE耐碳青酶烯类抗菌药物的主要β-内酰胺酶,可由染色体、质粒或转座子介导。目前发现的获得性金属酶包括IMP、VIM、GIM、SPM4种,以IMP和VIM常见。D类β-内酰胺酶即OXA酶(OXA-23~-27)常见于不动杆菌属,国外已在PAE中发现多种OXA型酶基因,国内相关报道较少,蒋晓飞等曾报道在8株多重耐药PAE中检出blaoxa-10型基因(同时还存在blaveb-1基因),诸葛青云等从28株IMPRPAE中检出1株blaoxa-10型基因。A类酶是青霉素酶,对亚胺培南的水解活性强于美罗培南,可引起青霉素类、氨曲南和碳青酶烯类耐药,第三代头孢菌素敏感,他唑巴坦、克拉维酸可以抑制此类酶,主要见于一些肠杆菌科细菌以及肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌中质粒介导的GES-2是2000年首次在南非发现,南非在一次由产GES-2型酶的铜绿假单胞菌引起的暴发流行死亡率达62.5%。本研究中IMP阳性菌株占17.6%,未检测到其他金属酶和碳青酶烯酶,提示产IMP型金属酶是PAE对IMP耐药的机制之一。oprD分为D1和D2,研究发现与亚胺培南耐药有关的为外膜孔蛋白(OprD2),铜绿假单胞菌外膜蛋白孔道是小分子的亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道,也允许带有阳性电子基团的各种糖类及碱性氨基酸非特异扩散。OprD2蛋白是目前所知的PAE外膜中惟一有助于抗菌药物通透的孔道蛋白,具有配体特异性,不仅能形成亚胺培南的特异结合位点,同时发现碱性氨基酸为亚胺培南的竞争性抑制剂。其他β-内酰胺类抗菌药物均不能通过OprD2通道,所以碳青酶烯类抗菌药物与其他β-内酰胺类抗菌药物无交叉耐药性。一般认为OprD2缺失是PAE对IMP耐药的主要机制,但本研究oprD2基因缺失占2.9%,与国内外相关报道差别较大,提示oprD2基因缺失不是本组IMPRPAE耐药的主要原因,但不排除因oprD2基因突变或基因表达下调导致PAE对IMP耐药,后续研究正在进行中。PAE细胞膜上的主动外排蛋白是导致PAE对多种抗菌药物表现固有或获得性多重耐药的原因,这些蛋白包括控制抗菌药物进出细胞的外膜通道蛋白、转运抗菌药物的内膜蛋白和膜连接蛋白。PAE细胞膜上的这些主动外排蛋白组成了主动外排系统,主要有MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM4种,其中MexAB-OprM最为重要。OprM表达过度可导致对青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青酶烯类、喹诺酮类、氯霉素、磺胺类药物耐药。CCCP为质子泵抑制剂的代表制剂,能破坏细菌跨胞浆膜的质子梯度,导致转运蛋白失去能量供应而起作用。一般认为CCCP作用使IMPRPA