地黄不同炮制品对糖尿病大鼠降糖作用的影响

地黄不同炮制品对糖尿病大鼠降糖作用的影响

增液汤是吴茱通在《温病条约》中记录的一个例子，它有助于降低血糖。鉴于地黄有鲜地、生地和熟地之分,因加工炮制方法不同,其化学成分及其含量则有所不同,推测地黄不同炮制品的组方药效亦可能存在差别。地黄生熟异用后增液汤降血糖作用是否有变化?目前尚未见到报道。本文首次将地黄不同炮制品纳入增液汤中进行地黄在复方中降血糖作用对比研究,旨在揭示地黄生熟异用对增液汤降血糖作用的区别,研究鲜地黄、生地黄和熟地黄降糖功效的差异,指导中医临床用药。鲜地-增液汤、生地黄、鲜单一克氏原试剂ss1.实验动物SD雄性大鼠,清洁级,体质量180-220g,由郑州大学医学院动物实验中心提供,动物许可证号:SCXK(豫)2010-0002,合格证号:0008680。2.实验仪器UV-3200紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);BMG型多功能酶标仪(江苏万科科教仪器有限公司)。3.药品与试剂链脲佐菌素(streptozotozin,STZ)(Sigma,批号:S0130);盐酸二甲双胍片(上海信谊药厂有限公司,批号:111128);肝糖原试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20120706);胰岛素(insulin,INS)试剂盒(批号:20120701A),葡萄糖激酶(glucokinase,GK)试剂盒(批号:20120701A),葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-Pase)试剂盒(批号:20120701A),丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)试剂盒(批号:20120701A),果糖激酶-1(fructokinase-1,PFK-1)试剂盒(批号:20120701A),均为美国RD公司。4.灌胃药液的制备4.1生地-增液汤取玄参30g,生地黄24g,麦冬24g,加10倍量水,煎煮0.5h,过滤,再加8倍量水,煎煮0.5h,过滤,合并滤液,浓缩制得0.78g/mL。4.2鲜地-增液汤其他制备方法同“4.1”项下,把生地黄换成鲜地黄48g(依据中国药典2010版鲜地用量加倍),压榨鲜地黄汁兑入即得。4.3熟地-增液汤取熟地黄24g,其他制备方法同“4.1”项下。大鼠血糖代谢关键酶活性检测1.分组及用药SD雄性大鼠70只,适应性喂养1周后,随机抽取10只为正常组,其余60只大鼠给予自制高脂饲料(蛋黄3%、蔗糖20%、猪油19%、基础饲料59%),4周后禁食12h,腹腔注射STZ溶液(35mg/kg),正常组注射同剂量的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH为4.2-4.5)。72h后测空腹血糖(FBG),以血糖≥11.1mmol/L为成模标准,选择50只造模成功大鼠,以血糖值为依据,随机分为模型组、对照组、鲜地-增液汤组、生地-增液汤组、熟地-增液汤组,每组10只。鲜地-增液汤组灌胃剂量为10.2g/kg;生地-增液汤组和熟地-增液汤组灌胃剂量均为7.8g/kg;对照组灌胃盐酸二甲双胍,给药剂量为0.15g/kg;正常组、模型组灌胃等体积的0.9%氯化钠溶液。连续灌胃给药3周,每周称体质量1次,根据体质量调整用药量。2.检测指标2.1血糖检测于给药前及给药1、2、3周后用葡萄糖试剂盒检测FBG。2.2胰岛素敏感性检测于给药3周后检测。即:大鼠禁食12h后,背部皮下注射0.4U/kgINS,剪尾取血,观察30、60、120min时血糖的变化情况。2.3血清胰岛素水平的测定末次给药后大鼠禁食12h,腹主动脉取血,按照试剂盒说明测定血清INS水平。2.4肝糖原含量的测定处死大鼠后,立即剥取大鼠肝脏,置液氮中冷冻后-70℃保存,按照试剂盒说明测定肝糖原含量。2.5肝脏糖代谢关键酶活性的测定肝脏用0.9%氯化钠溶液匀浆后按照试剂盒说明测定肝脏糖代谢关键酶GK,PFK-1,G-6-Pase,PK的活性。3.统计学方法应用SPSS17.0统计分析软件。计量资料数据以ue0af±s表示,组间比较用方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。对大鼠血清中的关键酶活性的影响1.对给药前后糖尿病大鼠FBG的影响见表1。与正常组比较,模型组FBG显著升高(P<0.01),说明造模成功;与模型组比较,生地-增液汤组FBG在给药第7天显著降低(P<0.01),鲜地-增液汤组FBG在给药第14,21天显著降低(P<0.05),熟地-增液汤组无显著性差异;与生地-增液汤组比较,熟地-增液汤组FBG在给药第7,14,21天均具有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。3.对糖尿病大鼠INS及肝糖原含量的影响见表3。与正常组比较,模型组血清INS水平和肝糖元极显著降低(P<0.01);与模型组比较,生地-增液汤组血清INS水平和肝糖原含量极显著性升高(P<0.01),鲜地-增液汤组肝糖原含量显著性升高(P<0.05),熟地-增液汤组无显著性差异;与生地-增液汤组比较,鲜地-增液汤和熟地-增液汤组血清INS水平具有极显著性差异(P<0.01),熟地-增液汤对肝糖元含量具有显著性差异(P<0.05)。4.对肝脏糖代谢关键酶活性的影响见表4。与正常组比较,模型组GK、PFK-1、PK显著降低(P<0.01),G-6-Pase显著升高(P<0.01),说明造模成功;与模型组比较,生地-增液汤组能极显著升高GK、PFK-1、PK和降低G-6-Pase(P<0.01),鲜地-增液汤组能显著性升高GK、PK和降低G-6-Pase(P<0.05);与生地-增液汤相比,鲜地-增液汤对PFK-1具有显著性差异(P<0.01),熟地-增液汤对GK、PFK-1、G-6-Pase、PK具有极显著性差异(P<0.05,P<0.01)。本研究结果显示生地-增液汤和鲜地-增液汤能升高血清INS水平和肝糖原含量来降低血糖和改善INS敏感性,说明这种作用的机制与减少INS抵抗大鼠肝糖原的合成,增加肝脏中降低的GK、PFK-1、PK活性,降低G-6-Pase活性有关,而熟地-增液汤对糖代谢的几个关键酶活性影响不大。本实验研究结果说明鲜地黄和生地黄具有降低血糖的作用,熟地黄降低血糖作用不明显,因此建议在临床降血糖方剂中应用鲜地黄和生地黄,不用或少用熟地黄。本次实验用药的剂量确定是根据《中华人民共和国药典》规定的人常用量按照人∶大鼠=1∶6换算而来,鲜地黄由于富含水分,取样量加倍。研究结果证明不仅熟地黄与生地黄作用有异,鲜地黄、生地黄之间也有差别,因此地黄不同炮制品在增液汤方剂中化学成分的差异有待进一步的研究。2.对给药后糖尿病大鼠INS敏感性的影响见表2。与正常组比较,模型组INS敏感性极显著升高(P<0.01);与模型组比较,生地-增液汤组和鲜地-增液汤组INS敏感性在30、60、120min时显著降低(P<0.01,P<0.05);与生地-增液汤组比较,鲜地-增液汤INS敏感性在30、60、120min时有显著性差异(P<0.01,P<0.05),熟地-增液汤在30、60min时有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。增液汤以养肝2型糖尿病是由于INS的分泌绝对不足或是由于某些抗INS作用的因素影响其生理作用而导致的一种内泌代谢性疾病。其典型症状是多尿、多饮、多食及消瘦,与中医的“消渴”病相似。“消渴”的病机主要是阴津亏损,燥热偏盛,每以清热生津、滋阴治之。增液汤由玄参(30g)、生地黄(24g)、麦冬(2