糖尿病肾病与链脲佐菌素

糖尿病肾病与链脲佐菌素

糖尿病和肾病是糖尿病的微血管并发症。近年来,随着胰岛素的应用,糖尿病的急性合并症病死率已明显减少,其慢性并发症如心、脑、肾并发症已成为死亡的主要原因。国外研究显示糖尿病病程达10~20年者50%合并糖尿病肾病,并且已成为糖尿病的主要死亡原因。2001年调查,我国2型糖尿病并发肾病的患病率为34.7%。然而,糖尿病肾病的病因和发病机制迄今尚未完全明了。因此,建立适当的动物模型,不仅为研究糖尿病肾病的病因、发病机制和病理生理改变提供重要的线索,而且能促进药物作用机制的研究和临床药物的开发。链脲佐菌素(strep-tozotocin,STZ)为一种广谱抗生素,具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用。其致糖尿病机制目前认为是STZ引起特殊位点烷基化,进一步导致多聚二磷酸腺苷(ADP)一核糖体激活,胞内辅酶I(NAD+)和三磷酸腺苷(ATP)耗竭,最终导致大量反应性氧簇产生。STZ对动物胰岛B细胞有很强的选择性杀伤作用,大剂量或小剂量多次注射可完全破坏胰岛B细胞功能,使胰岛素分泌缺失,随病程延长在高糖环境中可抑制肾脏细胞的增殖和凋亡,可进展为糖尿病肾病。本文就近年来STZ诱导大鼠糖尿病肾病模型研究作一综述。1解决大鼠模型成模率和体质量以提高制造模型成模率的需要,常用大鼠品系以Wistar和SD为主,国外有学者报道选用雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠,体质量以180~250g为宜。2stz分次注射所有大鼠注射STZ前禁食12~24h,禁食的时间越长,STZ对胰岛B细胞的破坏力越明显,即药效越高。杨亦彬等发现空腹鼠成模率显著高于非空腹鼠。注射STZ时用柠檬酸盐缓冲液以1%~2%的浓度溶解STZ,在30min内注射完毕。STZ只有pH4.2~4.5的时候才具有最佳药力活性。刘长青等采用pH4.5柠檬酸磷酸盐缓冲液(PBS),pH5.5、pH7.0Hanks,pH7.0生理盐水4种溶剂溶解STZ小鼠腹腔注射,观察溶剂及其酸碱度对模型的影响,pH4.5柠檬酸PBS造模成功率高达86.7%,酸性溶液成模率高。STZ溶液的配制、保存及应用很关键,其中溶剂浓度及pH值要符合要求,且现配现用;STZ溶液应充分混匀,避光保存,注射要快。3式压和剂量3.1糖尿病肾病大鼠模型建立方法一次性大剂量STZ注射致速发型糖尿病模型,制造方法简便、药物毒性较低、胰岛B细胞损伤特异性高。陈澍和刘雪芳采用大鼠禁食10h用STZ56mg/kg一次性腹腔内注射方式制作糖尿病大鼠模型,饲养10周后大鼠葡萄糖、糖化血红蛋白、血尿素氮、24h尿量、尿蛋白定量(24h)、尿白蛋白明显升高,血胰岛素显著下降;病理显示出现肾脏肥大,明显肾小球、肾小管病变。雷作熹等用STZ65mg/kg一次性腹腔注射方式制作糖尿病肾病大鼠模型,饲养14周,大鼠出现血肌酐、尿素氮、尿蛋白、尿白蛋白明显增高,病理显示明显的肾小球、肾小管病变。李桂云和吴正治分别按30、40、50mg/kg腹腔注射STZ建立2型糖尿病大鼠模型,40mg/kg剂量组大鼠的成模率最高(73.3%),成模大鼠具有高血糖、高胰岛素血症和血脂紊乱的2型糖尿病胰岛素抵抗的临床特征且高血糖持续时间最长、最稳定(到实验结束模型稳定至少28d),30mg/kg剂量组大鼠成模率只有40%,成模大鼠于实验结束血糖水平已基本恢复正常,50mg/kg剂量组成模大鼠倾向于1型糖尿病。李伟等采用腹腔一次性注射40、50、60、70mg/kg的STZ以建立糖尿病模型,腹腔注射STZ60mg/kg成模率高,模型死亡率(41.67%)较低。8周后大鼠尿微量白蛋白水平升高,肾脏超微结构检查系膜细胞增生、基质增多、肾小球基底膜增厚,70mg/kg组死亡率66.67%。杨亦彬等按55mg/kg腹腔注射STZ,空腹Wistar鼠成模率62.5%,SD鼠为87.5%,非空腹组成模率是10%,未成模鼠小剂量空腹追加STZ10~20mg/kg无一例成模,要达到理想的效果,往往是恢复到正常状态下重新造模。由此,腹腔注射50~60mg/kg是糖尿病肾病大鼠的理想剂量。3.2需要大量技术注射部位准确,药物吸收直接。但大鼠尾部角质层厚,尾静脉细长,注射需要一定技术。黄波等通过不同途径﹙腹腔非空腹、腹腔空腹、尾静脉﹚按65mg/kg注射STZ,结果非空腹腹腔注射组成模率较低为60%,空腹腹腔注射组成模率也较低为66.7%,尾静脉注射组成模率较高为93.3%。3.3两组临床指标比较此模型先诱导出胰岛素抵抗,再诱发胰岛素代偿性分泌障碍,但此模型有造模时间长的局限性。徐颖等给高糖高脂饲料12周时加用小剂量(40mg/kg)注射STZ可以显著升高血脂、醛糖还原酶(AR)、肾小球滤过率(GFR)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、糖化血红蛋白(HbA1c)等指标,与正常对照组比较差异有统计学意义。李璇等给雄性Wistar大鼠STZ30mg/kg腹腔注射,每只腹腔注射弗氏完全佐剂(CFA)0.1mL,STZ和CFA均每周1次,连续3周,血糖稳定升高后给予高脂饲量喂养达14周,CFA可增强胰岛B细胞对STZ的敏感性,模型动物可出现一系列与临床上糖尿病肾病相似的生化、尿液、病理组织学、免疫组织化学变化。3.4单独肾切除联合2型糖尿病造模方法单侧肾切除宜采用背部切口,切肾过程尤其应注意无菌操作,尽量减少动物损伤。切口尽可能小,操作尽量快而仔细熟练。实验过程应先切肾后注射STZ,如在注射STZ之后摘除肾脏,易增加动物死亡率。健康状态下切除单侧肾脏后,留存肾发生代偿性增生,但在病理状态下,肾脏代偿状态很容易被打破,因此行单侧肾切除再进行2型糖尿病造模可取得较为满意的结果。李敬林等采用单侧肾切除合并尾静脉注射STZ35mg/kg及单纯腹腔注射STZ50mg/kg两种方法造成糖尿病肾病大鼠模型,STZ+单侧肾切除组β2-微球蛋白、尿微量白蛋白的排出量较STZ组有明显增加,其病理改变也较明显。邢淑丽等通过单侧肾切除并腹腔空腹注射STZ45mg/kg(冬季)和35mg/kg(夏季)以建立大鼠糖尿病肾病模型,经过4批实验,8周和12周肾脏病理切片和电镜片均提示显著变化。王新和唐方等采用单侧肾脏结扎术+腹腔注射STZ(50mg/kg)及单侧肾脏结扎术+尾静脉注射STZ(40mg/kg)的方法建立糖尿病肾病模型,2组模型成功率差异无统计学意义,腹腔组血糖变异系数小于尾静脉组,并证实单侧结扎肾脏可出现与手术摘除结果相同的对侧肾脏代偿性肥大,且成模后8周存活率为90%(据经验单侧肾脏切除术+STZ诱导法4周存活率为50%)。3.5单肾切除单肾及高糖高脂饲料对大鼠肾质及脂质等指标的影响本法先以切除单肾造成另侧肾脏代偿性肥大,继而高糖高脂饮食诱导出胰岛素抵抗,再小剂量STZ腹腔注射部分破坏大鼠的胰岛B细胞,使大鼠出现高糖、高脂、高胰岛素血症,并出现糖尿病肾病的早期改变如肾小球高滤过、微量白蛋白尿等。查冬青等分别应用高糖高脂饮食加STZ30mg/kg腹腔注射及单肾摘除加高糖高脂饮食加小剂量STZ30mg/kg腹腔注射制备2型糖尿病肾病模型,单肾摘除组肾质量/体质量、血脂、尿蛋白定量、血肌酐,尿素氮及肌酐清除率较高糖高脂加STZ组有明显增加。徐颖等给高糖高脂饲料12周时行单肾切除+注射STZ40mg/kg建模后,大鼠血脂明显升高,GFR及氧自由基指标与空白组及几个模型组(对照组、高糖高脂饲料组,高糖高脂饲料+STZ组、高糖高脂饲料十阿霉素十STZ组)比较差异有统计学意义,醛糖还原酶(AR)活性升高。高苹和贾汝汉将雌性SD大鼠接受单侧肾切除手术2周后,给予高糖高脂饮食,喂养4周,再加用小剂量STZ30mg/kg腹腔注射。7周后,动物具有高血糖、高血脂、高血压等胰岛素抵抗特点,并出现DN相应的形态及功能改变。宋恩峰等采用单侧肾脏切除+高糖高脂+小剂量腹腔注射STZ30mg/kg,第6周时出现糖尿病肾病的早期改变如肾小球高滤过、微量白蛋白尿等。肾病理改变见大鼠肾小球体积明显增大,细胞数目增多,系膜区明显增宽,基膜增厚,严重者可见肾小球增生分叶。田雪飞等用小剂量STZ(40mg/kg)腹腔注射,饲以高脂饲料,单侧肾切除,结果肾小球系膜基质呈弥漫性无细胞增生,试验过程中动物总死亡率为25%,模型制作成功率为75.7%。4糖尿病大鼠血糖、尿量及尿量变化各报道标准不一,血糖多在注射STZ72h复查。糖尿病肾病大鼠毛色枯槁、污秽、无光泽,动物自发活动明显减少,大便较正常动物稀溏,有多饮、多尿、多食、消瘦的症状。李伟等认为空腹血糖持续高于16.7mmol/L并出现多饮、多尿、多食、体质量减轻为模型成功。杨亦彬等认为72h后至少连续3d尾静脉检测血糖。以连续3次血糖>16.6mmol/L,尿量>原尿量150%,24h尿蛋白排泄>30mg尿者为成模标准。陈澍和刘雪芳认为血糖值≥16.67mmol/L即算建模成功。李敬林等认为:①空腹血糖≥16.65mmol/L;②尿糖强阳性;③尿量大于对照组的50%即DN模型成立。雷作熹等认为成模标准:①血糖>16.7mmol/L;②尿糖≥+++;③尿量增加至少一倍。宋恩峰等认为2型糖尿病肾病大鼠需具备以下条件:①随机血糖≥16mmol/L伴胰岛素敏感性下降;②糖尿病肾病早期肾脏肥大;③肌酐清除率(Ccr)增加或出现微量白蛋白尿。只有持续的体内高血糖环境才能加速糖尿病肾病的形成,因此需要每周监测大鼠血糖。5预防感染的技能糖尿病大鼠尿量多,垫料潮湿,要勤换敷料;防感染,腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后,要注意消毒工作,可用四环素(或金霉素眼药膏)局部涂抹处理伤口预防感染;食物和饮水要充足,如血糖>35mmol/L,可补一些中效胰岛素。禁食后的大鼠,注射的时候已经处于低血糖状态,造模4h后腹腔注射20%的葡萄糖可避免因注射时血糖过低死鼠。6文血药浓度与肾组织学的关系静脉或腹腔一次性大剂量注射STZ造成的糖尿病模型是一种类似于人类1型糖尿病的动物模型,虽操作简便,胰岛B细胞损伤特异性高,但成模周期长,与2型糖尿病并发肾病的病理变化存在一定的差距。其中尾静脉注射需要一定技术且不能保证注入预想剂量,因为注射时药液渗出不可避免,而且要预防大鼠药物急性中毒。小剂量注射STZ配合高脂饲料的方法,类似于2型糖尿病,但出现肾功能变化时间较长。单侧肾切除合并注射STZ法导致对侧肾代偿性肥大,可以节省实验时间,但操作复杂,易增加动物死亡率。STZ合并单肾切除加高糖高脂饮食法模拟糖尿病患者的临床发病过程及代谢特征,但作为一种尚处于实验研究阶段的新的动物模型,该模型肾脏形态学变化与人类2型糖尿病肾病的病理变化并非完全一致,其与糖尿病肾病相关指标