糖尿病视网膜病变大鼠模型的建立和评价

糖尿病视网膜病变大鼠模型的建立和评价

糖尿病性尿失禁（ri）是糖尿病最严重、最常见的微血管并发症之一，也是最常见的盲性疾病之一。创建一个稳定可靠并与人类接近的动物模型是研究本病的重要基础［2］。本研究采用STZ诱导糖尿病大鼠,建立视网膜病变模型,并进行HE染色和透射电镜观察,结果如下。糖尿病大鼠血糖等情况检测1.实验动物及材料:实验动物为成年健康Wistar大鼠(由哈尔滨医科大学附属第一临床医学院提供)80只,雄性,体重200~250g,清洁级别。2.实验方法:将所有大鼠按随机数字表法分为空白对照组、糖尿病组1个月组、糖尿病组3个月组和糖尿病5个月组共4个实验组,每组20只。将所有大鼠适应性喂养1周,禁食水12h后,按60mg/kg腹腔内1次注射STZ(STZ溶于新配制的0.01mol/L,pH4.6的枸橼酸钠缓冲液)以诱发糖尿病;空白对照组仅注射等量的枸橼酸钠缓冲液。72h后在大鼠尾静脉采血,用血糖仪检测血糖浓度,凡空腹血糖浓度≥16.7mmol/L,尿量及饮水量均明显增多者视为造模成功的糖尿病大鼠。实验期间正常饮食,定期测量血糖及体重。3.取材与组织学处理:分别于造模成功后的1个月、3个月和5个月时用过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,迅速摘除眼球。①眼球摘除后立即固定于Verhoeff液中,48h后常规石蜡包埋,连续6μm切片用于HE染色;②脱蜡:二甲苯Ⅰ脱蜡10min,二甲苯Ⅱ脱蜡5min;③乙醇浸泡;④苏木精染色;⑤1%盐酸乙醇分化;⑥1%稀氨水反蓝;⑦伊红染色;⑧乙醇脱水;⑨二甲苯透明;⑩中性树胶封片,光学显微镜观察。4.透射电镜标本制备:①部分眼球摘除后立即去掉眼前节,浸入2.5%戊二醛溶液,取视网膜;②4%戊二醛前固定1h;③磷酸缓冲液冲洗2h;④1%锇酸后固定1h;⑤乙醇脱水;⑥Epon环氧树脂包埋;⑦聚合35℃、45℃、55℃各12h;⑧半薄切片光学定位(1μm),超薄切片机切片(70nm);⑨电子染色、醋酸铀、枸椽酸铅各15min;⑩透射电镜下观察并拍片。5.统计学方法:采用SPSS13.0统计软件对数据进行处理。数据呈正态分布用均数±标准差(ue0af±s)表示,若数据呈非正态分布采用中位数(4分位间距),M(Q)表示,P<0.05为差异有统计学意义。糖尿病患者视网膜结构表征1.一般状态:空白对照组大鼠的饮食、饮水及尿量均正常,体重随着周龄增大而逐渐增加,血糖正常,毛色光滑柔软,精神状况良好,行动灵活。糖尿病组大鼠每日的饮水、饮食及尿量明显增多,体重下降,血糖明显升高,毛色萎黄,精神萎靡,行动迟缓(表1)。2.普通病理HE染色:空白对照组视网膜各层结构完整,细胞形态正常,排列紧密(图1A)。糖尿病1个月组视网膜内、外颗粒层界限不清楚,细胞稀疏,排列稍紊乱,内、外网状层可见空泡(图1B);糖尿病3个月组视网膜神经节细胞层及内、外核层水肿;内、外颗粒层变薄,且界限不清楚,细胞稀疏,排列紊乱,出现空泡样变(图1C);糖尿病5个月组视网膜水肿较3个月重,内、外颗粒层细胞排列紊乱,界线消失,神经节细胞数量减少,神经节细胞层和颗粒层空泡样变性明显,可见血管样结构(图1D)。3.视网膜神经节细胞平均个数变化:在每张HE染色切片上随机选取20个相同固定面积、不重叠高倍(640倍)视野进行图像分析,采用麦克奥迪数码医学图像分析系统v6.0A,测定染色的视网膜神经节细胞平均个数。与空白对照组比较,糖尿病1个月组和糖尿病3个月组比较均有统计学差异(P<0.05);糖尿病5个月组差异有统计学意义(P=0.000,表2)。4.透射电镜观察:空白对照组视网膜色素上皮细胞核扁平,核内染色质密度高,色素颗粒较多,线粒体嵴清晰,细胞表面纤毛较多,内、外颗粒层细胞排列规则,视细胞膜盘结构清晰,排列整齐,血管内皮细胞的膜结构完好(图2A)。糖尿病1个月组视网膜色素上皮细胞核固缩,核膜增厚,核内染色质凝聚,色素颗粒减少,细胞表面纤毛倒伏,视细胞膜盘结构部分溶解,外颗粒层细胞间隙增宽,血管内皮细胞的膜结构完好(图2B);糖尿病3个月组视网膜色素上皮细胞色素颗粒减少,细胞表面纤毛溶解,线粒体嵴断裂,视细胞膜盘结构溶解,外颗粒层细胞减少,排列紊乱,毛细血管内皮细胞的膜结构不清(图2C);糖尿病5个月组视网膜色素上皮细胞色素颗粒明显减少,细胞表面纤毛溶解,线粒体嵴断裂,视细胞膜盘消失,外颗粒细胞排列紊乱,出现空泡样变,内网状层形成大的空泡,神经节细胞溶解,膜结构完全消失(图2D)。糖尿病大鼠视网膜结构变化的一般情况糖尿病视网膜病变是糖尿病最严重且最常见的微血管并发症之一,也是最常见的致盲性眼病之一［1］。它的发病与糖尿病的病程和血糖异常的严重程度直接相关［3］。DR的发病机制十分复杂,因此建立理想的糖尿病动物模型是研究糖尿病视网膜病变的重要基础。研究人员从1960年开始使用STZ诱发动物糖尿病模型,STZ能够直接损伤胰岛β细胞,导致胰岛素分泌减少,血糖升高,产生糖尿病,目前已经成为广泛使用的诱导糖尿病动物模型的化学制剂［4，5］。本研究采用经典的STZ诱导糖尿病大鼠的模型制作方法,结果成功建立了DR模型。从大鼠的一般情况可看出,腹腔注射STZ后大鼠表现出多饮、多食、多尿,大部分大鼠的体重下降,与空白对照组比较生长缓慢,与糖尿病的临床表现相符,表示造模成功(表1)。HE染色后可见糖尿病1个月组大鼠即出现视网膜改变,至5个月时视网膜病理改变明显,并可见血管样结构。同时笔者在每张HE染色切片上进行图像分析,测定染色的视网膜神经节细胞平均个数,与空白对照组比较,糖尿病1个月组和糖尿病3个月组视网膜神经节细胞平均个数减少(P<0.05);糖尿病5个月组明显减少(P<0.000)。另外,笔者还通过透射电镜观察STZ大鼠视网膜的超微结构,结果显示,在糖尿病1个月组大鼠即出现视网膜色素上皮细胞超微结构的变化,随着病情进展逐渐加重,至5个月时组线粒体嵴断裂,出现空泡样变,神经节细胞溶解,膜结构完全消失。通过以上STZ大鼠视网膜HE染色和透射电镜超微结构观察,笔者认为,本模型可以用作糖尿病视网膜病变的发病机制及治疗的研究。STZ诱发大鼠糖尿病模型被认为是最常用的有效且经济的方法,包括静脉注射、腹腔内注射、皮下注射等,通过腹腔内或静脉一次性给药,均能取得良好的模型效果［6，7］。但本模型对STZ的配制要求较高,因为STZ溶液极其不稳定,应该现配现用,且4