环氧化酶异构酶cox1和cox2在大鼠溃疡模型中的表达及活性变化

环氧化酶异构酶cox1和cox2在大鼠溃疡模型中的表达及活性变化

cycloxygendar，cox）是将宋朝磷酸转化为前后激素（如前列腺素和血卟啉）的速尿。这些代谢产物在许多生理和病理过程（如炎症）中发挥着重要作用。临床常用的非甾体抗炎药物就是通过抑制COX的活性而发挥其解热、抗炎和镇痛的药理作用。至今已有两种环氧化酶异构酶被识别并分别命名为COX-1和COX-2,它们在基因组定位、蛋白质结构、表达调节、分布及功能等方面具有较大差别。本研究探讨了两种COX异构酶在大鼠胃溃疡模型中损伤、炎症和愈合各阶段的表达和活性变化,以进一步揭示COX在溃疡病理中的表达规律及所起的作用。材料和方法一、动物胃毒性测定胃溃疡模型制备采用乙酸胃腔内注射诱导溃疡的方法。雄性SD大鼠(体重150~170g,共130只)经禁食24h,乙醚麻醉,上腹部正中消毒后取约1cm小切口暴露胃,胃的前壁和后壁用特制的两臂末端带有11mm直径环型结构的夹子夹闭,然后用注射器将0.12ml的60%的乙酸溶液注入夹闭的胃腔内,45s后将乙酸溶液抽出,放松夹子并回纳胃,腹壁逐层缝合,苏醒后送回动物房以标准饮食和饮用自来水喂养,直到标本采集。二、md大鼠产品完善和基因破碎率nm乙酸造模后1、2、6、12h,1、2、3、5、8和15d采集大鼠胃标本,沿胃大弯剪开胃壁,冷盐水洗涤后平铺,将溃疡边缘勾画在透明薄膜上,以便以后用每小方格1mm×1mm的坐标纸估算溃疡面积。收集(剪取)各时间组大鼠的胃溃疡基底、边缘(溃疡基底边缘1~2mm)和溃疡周围正常胃组织,每部位每只大鼠1~2份标本以铝箔包裹,置-70℃低温冰箱保存,以待RNA和蛋白质分析(各时间点4只大鼠胃组织)以及COX活性测定(各时间点8只大鼠胃组织)。另取部分各观察点胃溃疡组织以10%甲醛液固定行HE染色和观察。三、pcr扩增条件采用Trizol试剂(美国GIBCOBRL公司)提取各组标本的总RNA,以THERMOSCRIPTTMRT-PCR系统(GIBCOBRL)进行逆转录和PCR反应。扩增COX-1的引物对为:正义:5′TGCTGCTGAGAAGGGAGTT-CATTC3′,反义:5′CAAGTCACACACACGGTTATG-CTC3′,预计扩增产物为403bp,PCR反应条件为94℃5min,94℃1min,55℃1min,72℃1min共35个循环,72℃10min。扩增COX-2的引物对为:正义:5′ACACTCTATCACTGGCATCC3′,反义:5′GAA-GGGACACCCTTTCACAT3′,预计扩增产物584bp,PCR反应条件为94℃5min,94℃1min,54℃1min,72℃1min,共35个循环,72℃10min。内对照β-肌动蛋白的扩增引物对为:正义:5′GTGGGGC-GCCCCAGGCACCA3′,反义:5′CTCCTTAATGT-CACGCACGATTTC3′。预计产物为540bp,PCR反应条件为95℃2min;95℃30s,60℃45s,72℃1min,共30个循环;72℃10min。PCR产物以含0.5μg/ml溴乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外光照下以计算机图像分析系统成像和定量分析。四、蛋白浓度的测定各组标本以5∶1(v/w)比例置匀浆缓冲液(含50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,0.5%α-胆酸钠,0.1%SDS,2mmol/LEDTA,1%TritonX-100,10%甘油,1mmol/LPMSF,2μg/ml抑蛋白酶肽)匀浆破碎组织。匀浆液于4℃10000r/min离心15min,收集上清液并用Dye-binding(美国Bio-Rad公司)方法以牛血清白蛋白为标准测定蛋白浓度。取含30mg总蛋白的各组标本匀浆上清液点样进行7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离相对分子质量约72000的COX-1及COX-2蛋白。分子量标准采用预染的彩虹重组蛋白(英国Amersham公司)。电泳后的凝胶通过Western印记装置(Bio-Rad)电转移蛋白质至HybondC膜(Amersham)。转移膜经封闭,与1∶500稀释的COX-1或COX-2单克隆抗体(美国SantaCruz公司)4℃孵育过夜、洗涤,与1∶5000稀释的HRP-标记的羊抗鼠IgG(Bio-Rad)室温孵育1h和第2次洗涤,最后用ECLWesternblot荧光检测系统(Amersham)显色、曝光于X线底片(日本富士公司)和显影、定影。五、亮抑蛋白酶肽中pge2的表达COX活性测定采用Tomlinson等和Vane等介绍的方法,以组织匀浆液代谢花生四烯酸产生PGE2的量来表示。胃组织标本在含有50mmol/LTris.Cl(pH7.4),3.15%柠檬酸三钠,1mmol/LPMSF,0.2mmol/L亮抑蛋白酶肽的匀浆缓冲液(v/w20∶1)中4℃匀浆,留取部分匀浆液以Dye-binding方法测定蛋白含量,200μl匀浆液与过量花生四烯酸(30μmol/L)在37℃反应30min,然后沸水浴5min中止反应,12000r/min离心30min,用PGE2检测试剂盒(美国R&D公司)测定上清液中出现的PGE2浓度,结果用每mg蛋白每30min产生PGE2的ng数表示。六、统计方法统计学分析采用t检验。P<0.05为有统计学意义。结果一、性细胞及带皮细胞的抗炎作用溃疡在诱导后早期(30min~6h)可见黏膜层和黏膜下层充血、水肿和坏死形成溃疡基底;6h后可观察到中性粒细胞和巨噬细胞的浸润;1~3d溃疡基底主要表现为较多的中性粒细胞和巨噬细胞的聚集,是炎症最高峰期;之后溃疡进入快速愈合阶段,表现为溃疡边缘上皮细胞大量增生、隆起和快速迁移,溃疡基底肉芽组织的形成和血管再生,以及溃疡面积的缩小。15d以后有些溃疡完全上皮化,但结缔组织和微血管的重建仍要持续较长时间。二、cox-2基因表达正常胃组织可检测到少量COX-2的mRNA表达,而在诱导溃疡2h后COX-2的表达在溃疡基底迅速增加,并在24h达到高峰,持续高表达至5d后逐渐下降。而COX-1的mRNA表达在正常胃组织和溃疡诱导后各时相变化不大(图1)。溃疡基底在造模6h开始可检测到少量COX-2的蛋白,1d后迅速增加,并在5~8d达到检测高峰,而第15天时的溃疡基底仍保持较高水平的COX-2蛋白表达。不同于COX-2蛋白的表达模式,COX-1在正常胃组织就有较高水平的表达,溃疡诱导后早期2h和6h溃疡基底的COX-1蛋白含量有所下降,而随着炎症的消退和溃疡的愈合,溃疡基底的COX-1的蛋白水平恢复到正常(图2)。三、标准型mds-qp活性乙酸诱导胃溃疡后溃疡基底随时间的推移表现出越来越高的COX活性,在溃疡愈合晚期(第15天)的活性最强。溃疡边缘组织的COX活性表现出与基底相似的规律,2h~2d时高于溃疡基底组织,而3d始低于溃疡基底组织。区别于溃疡基底和边缘,溃疡周围的正常胃组织的COX活性变化较小,仅在3~8d时稍有增加,而第15天时的活性与正常对照相似(图3)。cox抑制剂的临床意义既往的研究发现COX-1结构性表达于大多数组织,包括胃肠道、肾脏、血管平滑肌和血小板等,而COX-2的表达除在少数器官如肾、脑、胰腺、卵巢、睾丸、支气管上皮细胞等外,在多数器官正常时不能检测到,但在炎症或丝裂原刺激下可在单核巨噬细胞、滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞中诱导表达;在卵巢和胎膜由激素诱导表达,其表达可上调10~20倍。本研究观察到COX-2在正常胃组织表达检测不出(COX-2蛋白)或很低(COX-2mRNA),而在胃溃疡模型的炎症期表达显著增加;COX-1的表达在溃疡诱导前后变化不大,这些结果与既往研究相符合。然而本研究还进一步发现在溃疡基底COX-2的表达和总COX活性在炎症高峰后的炎症吸收和愈合期具有更高水平,提示COX-2及其催化产物不仅是参与炎症反应的重要物质,而且可能在溃疡的损伤愈合和组织重建中起到更为重要的作用。炎症反应中,COX的作用是产生PGE2等重要的炎症介质和致热源,引起血管通透性的增加、炎症细胞浸润、发热以及降低疼痛域值引起疼痛的作用。而在损伤愈合过程中COX产物可能参与血管发生和细胞增生。已证实前列腺素类物质能够促进兔角膜的血管发生以及大鼠股静脉的血管芽生,COX的抑制剂消炎痛以及选择性COX-2抑制剂NS-398能够通过抑制丝裂原激活蛋白(MAP)激酶(ERK2)的活性等机制作用于血管内皮细胞而抑制血管发生,而MAP激酶是一种参与激活最终引起细胞增生和/或分化的转录因子以及早期反应基因的多种信号途径的重要中介。除血管再生外,溃疡愈合期的其他重要病理现象还有包括胶原在内的组织重建和溃疡基底的重新上皮化,而COX抑制剂被发现具有抑制胶原酶活性以及抑制黏膜细胞增生的作用,这提示COX及其催化产物可能是参与这些病理现象的重要物质,但其确切机制还需进一步研究来阐明。既往观点认为结构性表达的COX-1产生的前列腺素具有保护性和维持自稳的作用,抑制COX-1是导致NSAIDs药物的副反应的原因,特别是胃肠道副作用;相反,由于COX-2在炎症刺激下被诱导并引起花生四烯酸代谢的增强,因此,抑制COX-2被认为是非甾体类抗炎药物的抗炎、止痛等药理作用的原因。临床观察也发现使用选择性和高选择性COX-2抑制剂后发生胃肠道并发症的危险性较使用非选择性COX-1抑制剂时减少。然而越来越多的证据表明抑制COX-1对前列腺素的影响不足以完全解释NSAIDs的胃肠道副作用,COX-2缺陷的转基因小鼠溃疡的愈合延迟,而COX-1缺陷的转基因小鼠没有胃肠道自发性溃疡的发生;选择性COX-2抑制剂在动物实验中也被发现会加重大鼠胃的缺血-再灌注损伤(NS-398)和延迟乙酸诱导的溃疡愈合;临床也有使用高选择性COX-2抑制剂celecoxib后出现胃肠道穿孔的报道。这提示COX-2可能也具有促进