肾康丸对2型糖尿病大鼠血清nf-、il-6及p-sa3表达的影响

肾康丸对2型糖尿病大鼠血清nf-、il-6及p-sa3表达的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是2型糖尿病患者（md）常见的微血管并发症，难以治疗。近年来,大量研究证实,DM是一种慢性炎症性疾病,炎症反应是其发生和发展的重要因素之一,TuttleKR提出,DM是一种糖脂代谢紊乱引起的炎症性疾病。该观点日益受到重视,而针对DM(或DN)炎症反应的治疗亦受到较多关注。研究发现,与2型DM有关的炎症因子主要有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)系列、C反应蛋白(CRP)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、脂肪因子和其他如唾液酸、内皮黏附分子等,其中TNF-α可通过多种信号转导途径引起炎症因子升高,进而导致肾脏损害、胰岛素抵抗(IR)等,从而在DN的发生发展中起到关键作用。因此,抗炎治疗或成为DN的治疗措施之一。前期,笔者通过临床研究发现,肾康丸可降低早期DN患者血清中TNF-α、CRP、IL-6水平,产生肾脏保护作用。本实验通过观察给药后大鼠尿α1-微球蛋白(Uα1-MG)、血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、TNF-α、IL-6及肾脏磷酸化信号转导和转录活化因子-3(p-STAT3)表达的变化,进一步探讨肾康丸对2型DM大鼠产生肾脏保护作用的分子生物学机制。1材料表面1.130只wistar大鼠，2个月大，体重170.200g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：scxk粤2006-00151.2试验药物肾康丸由南方医科大学珠江医院药物系统一药。其活性物质为黄原、金盏子、水貂和母字，制剂号为20080424、6g/袋。支持信息。添加申国康氏有限公司，批号0714，12.5mg1.3主要试剂链佐菌素stz，sig，美国；u1-mg、血清tnf-i和il-6elisa试剂盒均由美国adl公司购买；兔子抗大鼠p-stat3igg一种抗动物、兔子抗大鼠r-afill和美国赛加尔特公司标记的羊抗兔子igg两种抗动物2方法2.1模型的制备和组成根据相关文献制作了2型大鼠模型。在7天的适应性喂食后，随机分为2组：标准饲料组正常对照组c组6份，并给标准饲料。24只基准小鼠d模型模型组，高脂肪高粱饲料标准大鼠饲料、糖、炒猪、面粉、蛋黄酱、63%、20%、15%、4%和2%。所有动物都自由地吃水。在高热量饲料4周后，d组大鼠腹腔注射链片30mg和c组大鼠c缓冲液。注射72小时后，术后腹部血糖比再次测量，连续两次腹部血糖值13.5mmol。注射d组19例，符合d组诊断标准。之后，将19例模型大鼠随机分为三组，并添加高脂肪糖：模型模型组m组，n.7；接受英普治疗组de组，n.6；肾康丸治疗组dns组，n.6。其中，d组口服二甲基贝5mg/kg，每周给胃两次。sd组每天服用1.8g/kg的肾康丸，每次服用1.88mg/kg，插入胃。c组和m组每天服用相应的体积生理盐水。治疗8周2.2收集和处理样本的小鼠，并在第四周和第八周收集尿液，检测u1-mg。在去世前一周，禁止12小时，称重体重，腹腔注射10%氯乙二醇300mg/kg麻醉动物，向腹部动脉采血，分离血清并将其储存在pp20c下2.3用自动生物化学分析仪检测bun和cr，用u1-mg、tnf-i和il-6进行观察和测试2.4以低于通常水平的肾组织为特征的p-stat3，以约50mg肾组织为特征的分子，在玻璃平板上测定肾组织，并添加ripa抗裂缓冲液以分解组织。冰浴1h，4'min，14000r*min。离心5min后，取出悬浮液，在奶味蛋白浓度分析试剂盒中测定蛋白质浓度。用ripa解释剂将每个孔20l的蛋白质作为50g，用8%十二烷基硫酸钠-聚吡咯烷基胶体进行电泳分析，然后转移到pvdf膜。对于50cml脱脂牛奶粉，添加p-stat3多克隆抗体1.04稀释。4后，在再次清洗膜后，添加过量标记的羊抗羊抗体1.2000稀释，并在37下培养1.5h。清洁膜后，加入ecl化学发光试剂，然后将pvdf膜放入凝胶分析系统biorad公司。这个是内部的2.5统计方法采用spss13统计软件。0.数据用x表示。采用离散度分析，组间比较采用一段时间。采用lsd法，离散度小于1tr33结果3.1治疗后，两组小鼠的u-1mg比较见表1。治疗4周和8周后，m组、da组和de组的u-1mg显著增加，与c组相比呈显著差异p0.01。m组和sd组之间的u-1mg差异显著p0.01。sso组和de组之间的差异没有显著差异p0.053.2表2显示了治疗后各组大鼠的bun和cr值的比较。治疗第8个周末，m组的bun和cr值水平升高，与c组相比有显著性差异p.0.01。de组和沉积物组的bun和cr值水平均下降，与m组相比呈显著性差异p.0.01，而c组则差异p.0.05。两组之间的bun水平低于de组，这是显著的p.0.05，两组之间的cr值没有显著差异p.0.053.3治疗后，两组大鼠的血清tnf-i和il-6级的差异见表3。在治疗8周后，m组的血清tnf-i和il-6级显著高于c组p.0.01。与m组相比，de-d组的tnf-i和il-6级显著低于a组p-0.01。两组之间的差异没有显著差异p0.05。三组和c组之间的il-6级差异没有显著差异p0.053.4治疗后，两组均发现肾脏p-stat3发现变化。治疗8个周末后，c组大鼠肾脏组织中的p-stat3仅出现少量迹象，而m组大鼠和c组小鼠的p-stat3表现显著增加。e组和sso组大鼠肾脏p-stat3的发现显著低于m组，两组之间的差异不明显4肾康丸和依那西普对dn治疗后肾功能的作用近年来研究发现,许多疾病均与亚临床的炎症反应有关,例如动脉硬化(AS)、2型DM及代谢综合征等。因此,Fernandez-RealJM等提出2型DM是一种慢性炎症性疾病的观点,炎症可能参与2型DM患者脂代谢异常、IR及AS等的发生。亚临床系统炎症标志物,特别是TNF-α、IL-6、CRP等在2型DM及代谢综合征中明显异常。在STZ诱导的DM大鼠血清中上述致炎细胞因子是升高的,并且肾小球系膜间质中TNF-α表达亦显著增加,而正常对照组肾组织几乎无TNF-α。这在笔者既往的临床研究中也证实了这点。DN作为DM的一种重要血管并发症,炎症反应对其发生发展同样起着关键作用,其中TNF-α在DN发病中的作用尤为重要。TNF-α作为炎症反应中关键的炎性细胞因子,可引发细胞因子的级联效应,同其他炎症因子一起与脂肪内分泌、氧化应激、免疫系统等相互作用,从而导致2型DM及其并发症的发生。TNF-α升高,可诱导IL-6、IL-1等炎症因子的合成增加。其中,IL-6与肾小球系膜细胞上的IL-6受体结合后,可激活下游的Janus激酶/信号转导和转录活化因子3(JAK/STAT3)信号通路,诱导JAK/STAT3信号转导途径的活化,从而导致STAT3蛋白的表达增加,磷酸化STAT3(p-STAT3)表达增强,后者进一步促进肾小球系膜细胞和血管内皮细胞TGF-β的分泌,最终导致细胞外基质增生和肾小管上皮细胞的转分化,引起肾脏损害。因此,TNF-α/IL-6/p-STAT3信号途径在DN的发生发展中有着重要作用。DN早期以微量白蛋白尿出现为标志。研究认为,DN早期,肾小球病变的同时存在肾小管损伤,甚至肾小管损伤早于肾小球病变,肾小管和肾间质的病变已经得到广泛的重视。α1-MG作为肾近曲小管受损伤的指标之一,明显早于尿白蛋白出现。本研究选择Uα1-MG作为DM大鼠肾损伤观察指标,经过8周治疗,肾康丸和依那西普均可降低患者Uα1-MG,前者作用更明显;对照组Uα1-MG与治疗前比未减少。说明已经发生了早期DN的改变。DN属中医学肾消范畴,早期辨证为气阴两虚、肾虚血瘀;随着病情进展,出现脾肾两虚、气虚血瘀。病机特点是本虚标实。因此,治疗DN应治本补虚、治标祛邪。肾康丸具有益气健脾、滋阴养肾、活血通络等功效。笔者的前期临床研究证实,给予肾康丸治疗后,可降低早期DN患者血清中TNF-α、IL-6、CRP等水平,产生不依赖于降脂及降糖的肾保护作用。本实验进一步表明肾康丸可以降低DM大鼠血清中TNF-α、IL-6等水平,同时,应用肾康丸治疗后,DS组大鼠较M组大鼠的一般状况得到明显改善,BUN、Cr显著降低,肾脏功能得到改善,并且肾康丸降低BUN的作用优于依那西普,肾脏组织p-STAT3的表达明显降低。说明肾康丸、依那西普均对DM大鼠起到肾脏保护作用,其机制可能与降低血清TNF-α水平,从而减少了由TNF-α所引起的IL-6分泌,使TNF-α/IL-6/p-STAT3信号通路下游的p-STAT3的表达减少,从而避免TGF-β等细胞因子的过度生成有关。本实验发现,使用依那西普治疗后,大鼠一般状况较肾康丸组改善明显,血清TNF-α、IL-6水平下降更低,但统计学上与肾康丸组之间并无差异