糖尿病大鼠早期肾病中西医造模方法的研究

糖尿病大鼠早期肾病中西医造模方法的研究

糖尿病性肾衰竭（dn）是由缺血和高血糖引起的一系列代谢障碍和血流动力学变化引起的肾衰竭。它所引起的肾衰是DN患者的主要死因,而DN发病率有逐年上升的趋势。现已证明DN早期即处于高功能状态,表现为肾血流量增加,肾小球滤过率增加等一系列血流动力学改变。并且此过程是可逆的,而一但出现临床肾病(即尿蛋白在200μg/min以上)则难以纠正。因此,如何建立糖尿病大鼠早期肾病模型,对DN的研究具有重大意义。中医认为糖尿病及早期DN属“消渴”范畴。其成因系由于饮酒或过食肥甘厚味等原因导致,而出现多饮多食,多尿等症状。因此予DN大鼠高脂饮食以探索有效的糖尿病大鼠早期肾病的痰浊血瘀型中医证候模型,并用具有祛痰化瘀功效的中药糖克煎剂进行治疗,以反证此中医证候模型是否成立。1材料和方法1.1动物雄性Wister大鼠(沈阳药物研究所提供),体重200~250g,共40只。1.2饲料①普通饲料及高脂饲料均购自沈阳市于洪区前民饲料厂。②高脂饲料配方:30%蛋白质,10%脂肪,其余为普通饲料。1.3试剂1.链酶素stz为美国Sigma公司生产,购自北京经科化学试剂公司。c-枸杞酸缓冲液枸椽酸及枸椽酸钠购自沈阳市西塔化学试剂商店,使用前一天配成0.1mol/L,pH4.2的缓冲液,置于4℃冰箱冷藏,备用。葡萄糖试剂盒北京北化精细化学品有限公司临床试剂分厂生产,批号:990962尿微白测试剂盒中国原子能科学研究所提供,批号:990121.4特效药糖克煎剂:由黄芪、黄精、泽蓝、竹茹等10味中药组成,按人体用量的7倍水煎浓缩成每毫升含3.2g生药的煎剂。1.5gord型①贝克曼生化仪。②放免设备:GammaGordⅡ型多种同位素测定仪。③西德产莱卡020-505.030型光学显微镜。④血流变技术分析仪:LBY-N6A。1.6血糖及血糖指标1.6.1造模方法及分组将40只大鼠随机分为4组,一组为正常组(10只),其余3组在腹腔麻醉状态下予左侧肾摘除,并将其中一组定为摘肾对照组(10只),余下2组于术后6天时按35mg/Kg予STZ尾静脉注射。正常组及摘肾对照组注入等量缓冲液。72h后测空腹血糖及尿糖,若达到下列标准者,即认为DN成立:①空腹血糖≥16.65mmol/L;②尿糖强阳性;③尿量大于对照组的50%。并按血糖轻重随机分为STZ对照组(10只),糖克治疗组(10只)。成模时予高脂饮食4周,然后改为普通饲料。1.6.2用药剂量及时间每日灌胃一次,连续用药4周。成模时糖克治疗组立即用药。各组用药如下:①正常对照组:等量生理盐水;②摘肾对照组:等量生理盐水;③STZ对照组:等量生理盐水;④糖克治疗组:中药糖克煎剂。1.6.3检测指标及方法实验期间采用眼眶取血,实验结束时采用颈动脉取血,用代谢笼收集24h尿。①空腹血糖:采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法,于造模后及处死前检测。②尿微量白蛋白:收集24h尿,于造模后及处死前检测。③肾血浆流量:用内生肌酐清除率表示,血、尿肌酐用生化方法,于处死前检测。④血脂:用生化方法,于处死前检测。⑤血流变:用生化方法,于处死前检测。1.6.4实验统计学处理应用SAS6.12统计软件进行分析处理,所用数据用x¯±sx¯±s表示,数据用方差分析及t检验。2结果2.1糖克治疗组与正常组治疗前后stz分表1显示:单侧肾摘除组尿Alb排出量高于正常组,低于其他各组。糖克治疗组明显低于STZ组。在注射STZ一周后即见尿微量蛋白出现,与资料相符。2.2治疗组和对照组糖克治疗组糖克治疗组聚合酶stz表2及表3显示:正常组、单侧肾摘除组及糖克治疗组无明显差异,三者均低于STZ组。仅糖克治疗组的聚积指数与STZ组无差别,考虑可能与实验误差有关。2.3滤波率的变化表4显示:单侧肾摘除组,STZ对照组及糖克治疗组均高于正常组,但STZ对照组位于各组之首。3讨论3.1血脂检测及补充现代医学对DN的发病机理尚未完全阐明。但现已证实,高血糖是发生DN的必要的先决条件,由此引发的高血脂、高血粘度是DN发生发展的促进因素。高血糖状态下,脂肪组织摄取葡萄糖及从血浆脂蛋白清除甘油三脂和脂肪酸的能力降低,脂肪合成代谢减弱,脂蛋白脂酶活性低下,导致血中游离脂肪酸和甘油三酯浓度升高,而高血脂可导致尿蛋白的排出。其机理可能是血脂通过改变肾小球基底膜的通透性,引起尿蛋白的排出。另外,血脂可使肾小球压力增高,并影响前列腺素代谢,改善血管阻力,使肾小球呈高滤过状态,尿蛋白排出增加,同时高血糖也可使红细胞膜和血红蛋白糖化,导致其变形和携氧能力下降,聚集性增加,血粘度升高。而血粘度增高,反过来又加重血管内皮损伤,微循环灌注下降,加速动脉硬化和血栓形成,从而促进DN形成和发展。早期DN归属于消渴范畴,祖国医学很早就对本病有一定的认识。《素问·奇病论》认为“此肥美之所发也。此人必数食甘美而多肥大,肥者令人内热,甘者令人中满,故真气上逆转为消渴”。《灵枢·五变》认为“五脏皆弱者,善病消瘅……夫柔弱者,必有刚强,刚强多怒……怒则气上,胸中蓄积,血气逆留……血脉不行,转而为热,热则消肌肤,故为消瘅”。总之,其基本病理特点是本虚标实,虚主要表现在脾肾气阴亏虚等,实则表现在痰饮、瘀血,与现代研究的DN具有高脂、高凝的特点相符合。3.2中西医dn模型的构建3.2.1尿微量蛋白成模和stz的形成目前DN模型的建立有二种途径:①静脉或腹腔注射定量链脲佐菌素(STZ)造成DM模型,然后依其自然病情发展成DN模型(大约3个月)。②单侧肾切除合并注射STZ:因单侧肾切除后导致对侧肾代偿性肥大,而肾肥大是DN的一个独立危险因素,若再予STZ注射,加速DN的形成,节省实验时间。此方法现已被人们接受。本实验结果显示,尿微量蛋白在成模一周后即出现,与资料相符。高血脂,高血液粘稠度,肾小球滤过率增加均符合DN。3.2.2糖尿病肾病动物模型目前中医单纯证候模型如气虚、血虚、阴虚、阳虚等已经出现,但复合证候模型尚不多见。本实验即将DN高粘高脂特点与中医证候理论相结合,根据Simionescu等给雄性Syrian金黄地鼠注射STZ并予高脂饮食,可诱发DM合并高脂血症的实验,将单侧肾摘除合并STZ,同时予高脂饮食,建立