牛子及其提取物对糖尿病大鼠肾脏gf-

牛子及其提取物对糖尿病大鼠肾脏gf-

随着经济的发展和人民生活水平的提高，中国糖尿病患者往往逐年增加。中国是世界上人口最多的国家之一，绝对人数远远超过西方国家。糖尿病性肾炎（dn）是糖尿病最常见的并发症之一。据许多欧洲和美国国家统计，由于dn，aig在末期（esr）下需要进行透析治疗的患者数量达到esr患者的35%。不久的将来,糖尿病肾病在我国必将成为导致终末期肾衰的最主要原因之一。我的导师陈以平教授在继承传统中医的精华的基础上,结合个人丰富的临床经验,提出用复方牛蒡子合剂治疗糖尿病肾病,并且已应用于临床,取得了良好的治疗效果。既往的研究已证实,复方牛蒡子合剂可改善糖尿病大鼠的肾脏病理改变,为了明确其主药牛蒡子对糖尿病肾损害的作用机制,我们针对单味药牛蒡子,以其对大鼠肾皮质TGF-β1和MCP-1mRNA表达的影响为依据,进行了一部分实验研究。1材料与方法仪器设备RNA/DNA定量检测仪:Pharmacia公司。PCR仪:PE公司。电泳仪及水平式电泳槽:Bio-Rad公司。凝胶数码成像仪及图像分析系统:AlphaInnotech公司。光学显微镜及摄像系统:Nicon公司。PCR引物合成检测大鼠TGF-β1的上游引物:TGF-UP:5’-CGAGGTGACCTGGGCACCATCCATGAC-3’;TGFβ1的下游引物:TGF-Down:5’-CTGCTCCACCTTCTTGGGCTTGCGACCCAC-3’;检测大鼠MCP-1上游引物:MCP-1-UP:5’-ATGCAGGTCTCTGTCACG-3’,MCP-1下游引物:MCP-1-Down:5’-CTAGTTCTCTGTCATACT-5’。检测大鼠β-Actin的内参引物:上游β-Actin-UP:5’-TGGGACGATATGGAGAAGAT;下游引物:β-Actin-Down:5’-ATTGCCGATAGTGATGACCT。(引物由上海博彩公司合成,引物用无菌水配制成50mM储存)。主要试剂(1)造模用试剂:链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma公司。(2)分子生物学试剂:异硫氰酸胍:Gibco公司。SuperScriptⅡ(SSⅡ)逆转录酶:Gibco公司。Oligo(dT):Promega公司。dNTPs(四种各100mM):Promega公司。TaqDNA聚合酶:Biostar公司及华美生物工程公司。2实验方法动物饲养大鼠饲养于本校实验动物中心清洁级动物室。实验期间,动物室温度控制在21~25℃,12h交替照明。大鼠自由饮水、进食,保持垫料干燥,每天换垫料2次。每笼大鼠不超过5只。分组设置造模前将所有大鼠随机分为两组:造模组和正常对照组(E组)。造模后选取符合模型标准的大鼠,随机分为4组:A组:牛蒡子粉组;B组:牛蒡子水提组;C组:牛蒡子醇提组;D组:模型组。糖尿病大鼠模型建立造模前大鼠禁食12h,链脲佐菌素(STZ)临用前用0.1mol/L、PH4.0的枸橼酸缓冲液配成1%的浓度,以55mg/kg体重的剂量,腹腔内一次性注射。72小时后检测空腹血糖和尿糖水平,以血糖>16.7mmol/L且尿糖检测在+++~++++以上作为模型入选。正常组仅予以等量的枸橼酸缓冲液腹腔注射。动物处理确定造模大鼠达到模型标准后,稳定3天后开始灌胃用药。A组每只鼠每日予12g含药饲料(含生药2.5g)后,可自由进食。B、C组每只鼠每日予0.5ml药液(相当于2.5g生药的提取物)灌胃,D、E组每只鼠予0.5ml自来水灌胃。每天统计各笼大鼠的饮水量,每周统计各笼大鼠的进食量,每周称量各大鼠的体重变化。标本收集与处理第6周末称量大鼠的体重,在无菌条件下,以戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,取双肾称重,双肾沿正中剖开,右肾置于液氮罐中,用于检测肾组织PKC的活性TGF-β1和MCP-1mRNA的表达。肾组织TGF-β1和MCP-1mRNA检测采用异硫氰酸胍法,具体步骤如下:组织标本总RNA抽提:①将一小块(约100mg)肾组织放入经高温烘烤祛除RNA酶的培养皿中,用手术剪剪碎后,迅速转移到高温烘烤和灭菌的5ml玻璃匀浆瓶中,加1mlTrizol,将匀浆瓶埋入冰中,启动电动匀浆器匀浆2min。②加入200μl氯仿,剧烈振荡后,室温放置2min。③用低温离心机,12000g,4℃离心10min。④将上清液转移到RNasefree的1.5ml离心管(Axygen)中,用200μl氯仿再次抽提一次。⑤上清(0.5ml)转移到RNasefree的1.5ml离心管中,加入500μl异丙醇,混匀,室温放置5min后,4℃12,000g,离心10min。小心移去上清,防止丢失沉淀。⑥用75%乙醇洗两次,每次700μl,7500g,4oC离心2min,尽可能彻底除去残余溶液,真空干燥3min。⑦RNA沉淀用100μlDEPC处理的无菌水溶解。⑧待样品全部溶解后,测定OD260和OD280。用该法抽提的RNAOD260/280比值在1.9~2.1之间。抽提RNA直接用于RT反应,按1OD=40ug确定的RNA的量。⑨采用1%Agarose甲醛变性电泳方法检测RNA的完整性。采用该法抽提的RNA没有发生RNA降解。电泳的具体方法略。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)RT反应:①在RNasefree的1.5ml离心管中,加入2μg总RNA,0.5μlRNaseInhibitor(Promega),2μl100ng/mlOligo(dT)15+18(15mer与18mer各50ng/ml,由上海博彩生物公司合成)和适量的DEPC处理的无菌水,使反应的总体积为9.5μl。混匀,65℃保温5min。取出室温放置10min。短暂离心将溶液收集到管底。②按下列次序加入试剂,进行RT反应:4μl5XFirstStrandBuffer(Gibco/BRL),0.5μlRNaseInhibitor(Promega),2μl100mMDTT(Gibco/BRL),2μl4XdNTPmix(dATP,dCTP,dGTP,dTTP各10mM),1μl200UMMLVReverseTranscriptase(Gibco/BRL)。③混匀,37℃保温60min。④90℃处理5min,冰上冷却,4℃温离心将溶液收集到管底,RT产物直接用于PCR扩增。PCR扩增:①引物同上所述。②扩增:PCR扩增条件如下:94℃45秒,预变性120秒,60℃退火45秒,72℃延伸60秒,循环35次,最后延伸300秒。DNA扩增结果检测和半定量分析:DNA扩增产物用1.6%的Agarose电泳和EB染色后用TanonGIS-1000数码凝胶图像分析系统分析。统计方法采用SPSS10.0进行实验数据统计。2实验结果一般情况正常组大鼠体重增长明显,精神状况良好,动作自如,反应灵敏,毛皮有光泽。DN模型组大鼠明显消瘦,多饮多尿、精神萎糜,反应迟钝,毛竖无光泽,动作迟缓。中药各治疗组精神状况均良好,动作自如,反应灵敏度较正常组稍差。肾组织TGF-β1和MCP-1mRNA表达结果(表1):本实验扩增的产物大小与预期值一致:目标片段TGFβ1400bp,MCP-1450bp;内对照为Actin240bp。RT-PCR的电泳结果见图1。A组:lane1=sample1~9B组:lane2=10~20C组:lane3=21~29D组:lane4=30~37E组:lane5=38~42M=pUC19MspIdigestTGF-β1mRNA表达:模型组>牛蒡子粉治疗组>牛蒡子水提物治疗组>牛蒡子醇提物治疗组>正常组。模型组比正常组高,差异显著。各用药组比模型组低,有显著性差异;牛蒡子醇提治疗组及牛蒡子水提组与正常组相比较无显著性差异,此2组TGF-β1mRNA表达低于牛蒡子粉组,有明显差异(P<0.05)。MCP-1mRNA表达:模型组>牛蒡子水提物治疗组>牛蒡子粉治疗组>牛蒡子醇提物治疗组>正常组。模型组较正常组及各用药组高,差异显著;牛蒡子醇提物治疗组、牛蒡子粉治疗组比牛蒡子水提物治疗组低,差异显著(P<0.05),牛蒡子醇提治疗组与正常组相比较无显著性差异。3作用机理讨论减轻肾皮质单核趋化蛋白(MCP-1)mRNA的表达MCP-1是最重要的趋化单核细胞在组织浸润的细胞因子。MCP-1是主要趋化、激活巨噬细胞的趋化因子,研究认为肾小球中单核细胞的浸润与ECM的积聚及肾小球硬化症的发展相关联。Rovin等研究表明DN时肾脏局部能合成MCP-1,且与肾小球损伤有关。MCP-1在DN患者中增高的可能机制为:(1)长期的高血糖代谢紊乱是DN发病的根本原因,而高糖有直接刺激MCP-1mRNA表达及蛋白含量增高的作用,该作用可能是由PKC介导,用PKC抑制剂可降低高糖环境中的MCP-1。(2)DN患者中IL-1、TNF-α、PDGF等细胞因子均增高,它们可刺激肾脏内皮细胞、系膜细胞表达高水平的MCP-1。(3)DN患者存在血脂代谢紊乱,其升高的低密度脂蛋白(LDL)及其氧化产物OX-LDL均可刺激系膜细胞MCP-1mRNA表达增高。本试验结果显示:牛蒡子醇提治疗组可减轻MCP-1mRNA表达,提示牛蒡子提取物可能通过减轻MCP-1mRNA表达而改善糖尿病大鼠的肾损害。降低转化生长因子-β(TGF-β1)mRNA的表达肾小球多种实质细胞,尤其是系膜细胞,可丰富的表达TGF-β1mRNA,合成和分泌TGF-β1,并拥有TGF-β1特异性受体。TGF-β1增加系膜细胞所有细胞外基质成份,如胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、纤维连接蛋白、层粘连蛋白(laminin)、蛋白多糖及mRNA表达、合成和分泌;TGF-β1可使肾小球上皮细胞纤维连接蛋白、蛋白多糖、decorin及胶原蛋白合成增加,抑制细胞外降解酶的合成和活性。TGF-β1还可抑制组织蛋白水解酶mRNA的表达、合成和分泌,使细胞外基质降解减少,刺激某些蛋白水解酶抑制剂的产生,有效的使蛋白水解酶活性降低,致细胞外间质成份稳定升高,促进肾小球硬化。可见,TGF-(β1是糖尿病肾小球硬化的一个生长介导因子。众多实验及临床研究表明:糖尿病大鼠及糖尿病肾病患者活检组织TGF-β1mRNA的表达及蛋白含量均明显升高,同时伴肾脏肥大和细胞外基质增生。Shankland发现糖尿病大鼠2周时,其肾脏皮质TGF-β1mRNA表达较正常大鼠高2~3倍。Nakamura观察到糖尿病大鼠24周肾小球内TGF-β1比正常大鼠高4倍。TGF-β1在DN发病中作用可概括为:促使肾脏肥大,增加系膜细胞外基质的产生,并通过增加基质降解酶抑制物的活性,抑制基质降解酶合成,减少ECM的分解。大量研究表明,TGF-β1在促进肾小球病变发生、发展过程中起着重要作用,如调节肾小球固有细胞增殖,促进ECM合成和分泌,改变基质降解酶及其抑制因子的表达量和活性等。肾脏肥大可能与TGF-β1表达增强有关。TGF-β1可能为DN发病机制的最后通路:高血糖状态下,有多种生化异常及微循环障碍共同参与DN的发生发展,包括蛋白激酶C的激活、蛋白非酶糖化、氧化应激、肾素-血管紧张素系统活性增