基因工程：DNA重组技术的基本工具

生物技术基础理论和技术的发展催生了基因工程1、DNA是遗传物质的证明2、DNA双螺旋结构和中心法则的确立3、遗传密码的破译4、基因转移载体的发现5、工具酶的发明6、DNA合成和测序技术的发明7、DNA体外重组的实现8、重组DNA表达实验的成功9、第一例转基因动物问世10、PCR技术的发明生物科学苏云金杆菌毒蛋白基因毒蛋白棉花细胞杀死害虫抗虫棉的培育一、DNA重组技术1、DNA重组技术的概念：又叫做基因工程或基因拼接技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。对象：环境：过程：水平：结果：生物体外基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达定向改造生物的性状或获得人们所需要的基因产物2、DNA重组技术的原理：DNA重组技术是把一种生物的某种基因作为整体转移到另一种生物体的细胞内，基因仍然具有一定的独立性和完整性；基因的结构基本没有变化，只是位置发生了改变，所以属于基因重组。3、DNA重组技术的优点：可以实现基因在不同种生物之间的转换，可以打破有性生殖的远缘杂交不亲和的生殖障碍，迅速培育出前所未有的新品种。二、DNA重组技术的基本工具1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

2、DNA连接酶——“分子缝合针”

3、进入受体细胞的载体——“分子运输车”

（准确切割DNA的工具。）（DNA片段的连接工具。）（转移基因的工具。）1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

①存在：主要从原核生物中分离纯化出来的。③特点：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。④实例：EcoRⅠ限制酶能专一识别GAATTC序列，并在G和A之间切割。SmaⅠ限制酶能专一识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割。⑤切割结果：一般产生2个带有黏性末端或者是平末端的DNA片段。②作用：基因工程中重要的切割工具，能将外来的DNA切断，对自己的DNA无损害。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是一种防御工具，当外源DNA侵入时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之不能表达而失效，保证自身的安全。这是生物长期进化的过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断。限制酶在原核生物中的作用是什么？为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？思考与讨论：1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”特点：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。EcoRⅠ限制酶EEscherichia大肠杆菌（属）cocoli大肠杆菌（种）RRY13R菌株（品系）Ⅰ首先发现在此类细菌中发现的顺序从大肠杆菌R菌株中分离出的第一种限制酶EcoRⅠ限制酶能够专一识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。黏性末端（可互补配对）思考：限制性内切酶切割的是什么？限制酶切割的是：在DNA分子骨架上，两个相邻的脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。AAGTTTTCCGAA限制酶切割DNA分子之后形成了什么？EcoRⅠ（在G与A之间切割）SmaⅠ（在G与C之间切割）黏性末端（在中轴线两侧切割DNA）平末端（在中轴线处切割DNA）中轴线思考：如果把两种生物的DNA用同一种限制酶来切割，会怎么样呢？会产生相同（互补）的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组DNA分子了。G

AA

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CC

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G双链断开双链断开不同来源的DNA片段结合2、DNA连接酶——“分子缝合针”

思考：DNA连接酶连接的是什么？将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。形成新的磷酸二酯键AAAAGGTTTTCC①作用对象：两个具有相同黏性末端的DNA片段。②作用位置：脱氧核糖与磷酸之间的缺口。③作用结果：连接磷酸和脱氧核糖形成磷酸二酯键，即形成重组DNA。DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质构成的酶不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键1、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：种类E·coli

DNA连接酶T4DNA连接酶来源连接末端类型共性T4噬菌体大肠杆菌只能连接黏性末端既可连接黏性末端，又可连接平末端。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。2、根据酶的来源不同，可以分为两大类：注*：T4DNA连接酶连接平末端的效率比较低。3、进入受体细胞的载体——“分子运输车”

①作用：②特点：（运载体必须具备的条件）a、将目的基因转移到受体细胞中。b、利用它在受体细胞内对目的基因进行自我复制。a、能在受体细胞内自我复制并稳定保存，并且对受体细胞无害。b、具有多种限制酶单一切点，便于与多种外源基因连接。c、具有某些标记基因，便于目的基因的检测。③常用运载体——质粒：存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中，是拟核或细胞核外能够自主复制的很小的环状DNA分子。也可以用噬菌体（细菌病毒）或动植物病毒。b.限制酶切割位点c.标记基因a.能复制并带着插入的目的基因一起复制。质粒病毒（噬菌体和动植物病毒）在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。1、限制性内切酶；2、DNA连接酶；3、基因进入受体细胞的载体。总结1、总结本节课的主要内容；2、完成P**的课后练习题；3、完成本节课的**和**；4、预习第一章第二节《基因工程的基本操作程序》。课下作业本章总概念图本节概念图科技探索之路20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1、1944年，艾弗里（O.Avery）等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。艾弗里等人的工作可以说是基因工程的先导。基础理论和技术发展催生了基因工程2、1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型，使生物学进入分子水平。1958年梅塞尔松和斯塔尔，以大肠杆菌为实验材料，运用同位素示踪技术，用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的。1957年克里克提出中心法则的确立。3、1963年，尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验，破译编码氨基酸的遗传密码。技术发明命使基因工程的实施成为可能1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力，为基因转移找到一种运载工具。1970年阿尔伯（W.Arber）、内森斯（D,Nathans）、史密斯（H.C.Smith）细菌中发现了第一个限制酶。1、基因转移载体的发现2、工具酶的发现1972年伯格（P.Berg）首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子。4、

DNA体外重组的实现1977年科学家又发明了DNA序列分析方法。1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术。3、DNA合成和测序技术的发明1973年，博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中，转录出相应的mRNA，并使外源基因可以在原核细胞中成功表达，至此表明基因工程正式问世。1973年，科学家才将质粒作为基因的载体使用。这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验。1973年，科恩第一个建成“基因工程菌”，并创立基因工程模式。科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的专利技术。科恩被称为基因工程发展史上