植物转基因技术的应用与展望

植物转基因技术的应用与展望

植物遗传改良在人类发展史中发挥着重要作用。从古代植物的驯化到20世纪初植物育种的建立，人类逐渐致力于改善植物遗产，为人类服务。传统的育种方法实际上是以基因突变和有性杂交为基础的,某种植物可利用的种质资源由于生殖隔离等特性而局限在一个非常有限的范围内,这就使植物的遗传改良在很大程度上受到了限制。始于20世纪70年代的植物基因工程研究为拓宽植物可利用基因库提供了新的可能,从而为植物的遗传改良开辟了一条新途径。植物转基因研究的目的是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入、整合到受体植物的基因组中,并使其在后代植株中得以遗传和表达,从而使受体植物获得新的性状。1983年第一株转基因植物(烟草)的获得,开始了利用转基因技术改良植物种性的时代;1985年Horsh等人首创了叶盘转化法,使得农杆菌转化过程大为简化,从此植物基因转化研究得到了迅速发展,其它转基因技术也日趋成熟。目前,已有百余种转基因植物问世,水稻、玉米、棉花、油菜、大豆、烟草、甜菜、亚麻、南瓜、马铃薯、番茄、西葫芦、番木瓜、菊苣等10余种作物的上百个转基因品种被批准进行商业化生产。1996年全球转基因作物种植面积仅170万公顷,1997年和1998年分别迅速增加至1100万公顷和2780万公顷,1999年达到了3990万公顷。目前至少已有12个国家进行了转基因作物的商业化生产,其中美国1999年转基因作物种植面积达2870万公顷,占全球转基因作物种植面积的72%;阿根廷和加拿大的种植面积分别为670万公顷和400万公顷,分别占全球的17%和10%;中国的种植面积约30万公顷,尚不足全球的1%。美国转基因大豆、玉米、棉花品种的种植面积分别占该作物的种植面积的50%,33%和55%;阿根廷转基因大豆品种的种植面积也占到其大豆种植面积的90%;加拿大转基因油菜品种的种植面积占其油菜种植面积的62%。尽管目前商业化生产的转基因作物的性状改良仅仅涉及耐除草剂、抗虫、抗病毒、耐储藏等几个方面,但转基因技术无疑已成为当今植物遗传改良的重要手段之一,其应用前景越来越受到重视。1基于基因的植物形态改良研究虽然目前目的基因的分离克隆技术已取得了长足的发展,但可用于植物性状改良的基因仍然相当有限,尽管如此,利用转基因技术开展植物遗传改良研究的范围也已相当广阔,所涉及的植物性状主要包括以下几个方面。1.1抑菌基因检测虫害是造成农业减产的重要原因之一,化学农药和生物农药的使用虽然可以在一定程度上减少产量损失,但长期大量使用农药不但费用较高,而且易使害虫产生很高的抗药性,同时还会造成农药残毒和环境污染,重要经济植物种质库中几乎没有相应的抗虫资源,因此基因工程技术在该领域的应用研究最为活跃。将编码具杀虫活性产物的基因导入植物后,其表达产物可以影响取食害虫的消化功能,抑制害虫的生长发育甚至杀死害虫,从而使植物获得对取食害虫的耐性,减少或替代农药的使用。目前用于植物抗虫基因工程的基因主要包括以下几类:(1)毒蛋白基因,如苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白基因等;(2)蛋白酶抑制剂基因,如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)等;(3)淀粉酶抑制剂基因,如菜豆α-淀粉酶抑制剂基因等;(4)植物外源凝集素类基因,如雪花莲外源凝集素(GNA)基因等;(5)昆虫特异性神经毒素基因,如蜘蛛毒素基因等。这些基因的表达产物都具有相当的杀虫活性并具有一定的专化性,对人及哺乳动物并不构成危害。目前苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因已导入了番茄、烟草、马铃薯、水稻、玉米等植物,转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的烟草、棉花等,转菜豆α-淀粉酶抑制剂基因的烟草、豌豆等,转雪花莲外源凝集素基因的马铃薯、烟草、番茄、水稻、小麦等植物也相继问世,并在不同程度上表现出了对取食害虫的抗性,其中,转Bt毒蛋白基因的抗棉铃虫棉花、抗玉米螟玉米、抗块茎蛾马铃薯、抗果虫番茄等已进行商业化生产。1999年全球转基因抗虫作物品种的种植面积近1180万公顷。1.2菌株的致病性病害也是造成植物减产的重要原因之一,传统植物抗病育种在病害防治中发挥了重要作用,但由于植物病原菌致病小种进化相对较快,传统抗病育种手段往往因育种年限较长使生产中应用的主要品种在较长时间内必须借助化学杀菌剂来进行病害防治。由于基因工程方法能在短时间内使植物获得基因纯合的目的性状,从而为植物抗病育种提供了新途径。植物对病原菌的抗性机理至今尚不十分清楚,因而相应抗病基因的克隆较为困难,目前用于植物抗菌基因工程研究的基因比较庞杂,抗菌机理也很复杂,主要包括以下几种类型:(1)抗病基因,如白叶枯病抗性基因Xa21等;(2)解毒酶类基因,如对烟草野火毒素具有解毒作用的ttr基因、对草酸毒素起作用的草酸氧化酶基因germin等;(3)抗菌肽及抗菌蛋白类基因,如人溶菌酶基因HL、天蚕素基因Cecropin、兔防御素基因NP-1、核糖体失活蛋白基因RIP等;(4)病程相关蛋白类基因,如几丁质酶基因、葡聚糖酶基因等;(5)活性氧类基因,如葡萄糖氧化酶基因GO等;(6)植保素类基因,如芪合酶基因等。白叶枯病抗性基因Xa21可明显提高水稻品系的抗性;ttr基因导入烟草后,已获得了高抗烟草野火病的株系,将大麦根草酸氧化酶基因导入油菜后也增强了其对草酸的耐受性;转天蚕素基因Cecropin的烟草也获得了一定的抗菌性;几丁质酶基因和葡聚糖酶基因成功地介导了黄瓜对灰霉病、番茄对枯萎病的抗性;源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因GO导入马铃薯后大大提高了其对软腐病的抗性。1.3病毒诱导的抗性病毒是造成植物病害的另一个主要原因,自1986年将烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因导入烟草,获得了第一例抗病毒转基因烟草后,植物抗病毒基因工程的研究日趋活跃。目前抗病毒基因工程研究的策略主要有以下几种:(1)病毒复制酶介导的抗性:主要利用源于病毒的复制酶基因干扰病毒的复制,如黄瓜花叶病毒复制酶基因、烟草花叶病毒复制酶基因、番木瓜环斑病毒复制酶基因等;(2)病毒外壳蛋白介导的抗性:主要是利用本无毒性的病毒外壳蛋白抑制病毒的复制或激发宿主的抗性反应,如烟草花叶病毒外壳蛋白基因、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因、大麦黄矮病毒外壳蛋白基因等;(3)失活的病毒移动蛋白介导的抗性:主要是利用编码失去活性的病毒移动蛋白的基因干扰病毒的扩散和转移,如烟草花叶病毒移动蛋白基因等;(4)病毒基因相关序列介导的抗性;主要是利用病毒基因反义序列、核酶(一种能够特异性切割RNA的RNA)基因等抑制病毒基因的复制、剪接和表达,如马铃薯卷叶病毒基因的反义序列等;(5)其它来源的基因介导的抗性,如核糖体钝化蛋白类基因、抗体基因等。目前已获得了转番木瓜环斑病毒复制酶基因的抗病毒番木瓜等,转烟草花叶病毒外壳蛋白基因的抗病毒马铃薯等,转马铃薯卷叶病毒17kD移动蛋白突变体基因的抗病毒马铃薯等,转多种病毒外壳蛋白基因反义RNA序列的抗病毒烟草等。这些转基因抗病毒植物的获得大大拓宽了植物抗病毒研究的思路和视野,并创造了大量抗病毒新种质。至1999年,美国已批准了转基因抗病毒马铃薯、西葫芦、番木瓜品种进行商业化生产。我国也已有转基因抗病毒烟草、番茄和甜椒品种获准商业化应用。1999年全球转基因抗病毒作物品种的种植面积接近10万公顷。1.4抗菌类物质以及其它抗机构除草剂在植物生产中应用广泛,对减轻草害损失起到了重要作用,但是新型安全除草剂的开发难度大、费用高、耗时长,同时多数除草剂的除草范围有限,在植物的生长季节中往往需要多次使用多种除草剂,更增加了成本、加重了环境污染,少数广谱除草剂的的杀灭范围往往又包括了需要保护的植物品种,因此,与高效广谱安全的除草剂相结合,利用现代生物技术手段选育特异性抗除草剂植物品种,就成为当今的一大重要研究课题,在地广人稀、劳动力成本较高的国家和地区,该领域的研究尤为活跃。抗除草剂基因的研究往往是与广谱高效除草剂相结合的,利用的基因主要包括两类,一类是可以改变除草剂靶物敏感性的基因,另一类是除草剂解毒基因。它们主要针对以下几种除草剂发挥作用:(1)草甘膦(Glyphosate):它是目前应用最为广泛的非选择性除草剂,其作用是特异性地抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性,利用源于细菌、植物抗性细胞系的EPSPS基因可以大大提高植物对草甘膦的耐受性,这类基因导入烟草、大豆、番茄、马铃薯、棉花、玉米等植物后已获得了大量耐草甘膦的株系。(2)草丁膦(Glufosinate,Phosphinothricin(PPT)):是一种灭生性除草剂,是一种谷氨酰胺类似物,可抑制谷氨酰胺合成酶(CS)的作用,使氨积累造成植物中毒,源于土壤细菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因和Streptomycesviridochromogenesd的pat基因可以编码草丁膦乙酰转移酶(PAT),能够使草丁膦的自由氨基乙酰化从而对其解毒,目前bar基因已导入烟草、番茄、马铃薯、拟南芥、水稻、小麦、玉米等植物,获得了大量草丁膦抗性株系,但一般是把它作为筛选标记基因加以利用的。(3)磺酰脲类及咪唑啉酮类除草剂:这类广谱性除草剂的作用是抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)的活性,从而影响缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的合成,将拟南芥变异的ALS基因及源于烟草的SURB-Hra导入番茄、甜菜、油菜、苜蓿、玉米、亚麻等植物后都获得了耐除草剂植株。(4)溴苯腈:是光系统Ⅱ的强抑制剂,能通过与醌联蛋白结合抑制电子转移,源于土壤微生物Elebsiellaozaenae的bxn基因编码的腈水解酶可以降解溴苯腈从而对其解毒,该基因导入烟草、棉花、番茄、小麦等植物后也获得了抗性植株。(5)2,4-D:是一种生长素类似物,可选择性地抑制双子叶植物的生长,源于细菌Alcaligeneseutrophus的tfDA基因编码的2,4-D单氧化酶可以将其氧化解毒,该基因已在大豆等双子叶植物中显示了作用。抗除草剂转基因植物是最早进行商业化应用的转基因植物之一,现已有水稻、玉米、棉花、大豆、油菜、甜菜等作物的抗除草剂转基因品种进行商业化生产。1999年全球转基因抗除草剂品种的种植面积约3100万公顷(其中约290万公顷兼具抗虫性),约占转基因作物种植面积的78%,其中美国转基因抗除草剂大豆和棉花的种植面积分别达到了1500万公顷和230万公顷,占其相应作物种植面积的50%和近40%;阿根廷转基因抗除草剂大豆的种植面积占其大豆种植面积的90%,达640万公顷;加拿大转基因抗除草剂油菜的种植面积占其油菜种植面积的62%,达340万公顷。植物抗除草剂基因工程研究中应特别注意转基因植物与田间杂草杂交的可能性,及植物本身转为杂草的可能性。1.5营养方面的基因盐碱、旱涝、不适温度、强光、农药残毒等环境逆境在一定程度上限制了具经济价值植物的产量和种植范围,为了更充分地利用现有耕地、提高产量,植物抗逆育种一直都较受重视,但由于抗源少、抗逆机理不明,其研究进展不够理想,现代生物技术的发展为改变这一局面提供了新的可能。目前用于该领域的基因大体有以下几类:(1)逆境诱导的植物蛋白激酶基因,如受体激酶基因、促分裂原活化蛋白激酶基因、核糖体蛋白激酶基因、转录调控蛋白激酶基因等;(2)编码细胞渗透压调节物质的基因,如1-磷酸甘露醇脱氢酶基因mtlD、6-磷酸山梨醇脱氢酶基因gutD、HVA1蛋白基因等;(3)超氧化物歧化酶(SOD)基因:可以消除恶劣环境使植物产生的活性氧基(O),如Mn-SOD基因等;(4)类黄酮途径相关酶基因:可以辅助形成紫外屏蔽物质类黄酮,如苯丙氨酸解氨酶基因等;(5)防治细胞蛋白质变性的基因:如编码蛋白族HSP60、HSP70的基因;(6)前面提及的除草剂解毒基因等。目前已获得了耐盐碱的转基因烟草、玉米、水稻等,耐土壤农药残毒的转基因亚麻已在美国进行商业化生产。1.6植物结构基因的应用随着人们生活水平的不断提高,植物产品的品质越来越受到重视,但某种植物的品质相关性状往往是受多基因控制的数量性状,并且往往与产量相关,利用常规杂交育种方法,由于要在缺乏有效选择手段的条件下对多个基因进行操作,并且还要不影响其产量,其选育难度是可想而知的。利用外源物种的某些关键基因虽然为改善这一局面提供了很好的思路,但物种间严格的生殖隔离,又常常使这些想法变得可望而不可及。基因工程技术由于在一定程度上可以拓宽植物可利用基因库,近年来在植物品质育种中较受重视,并取得了一定的成绩。目前利用植物基因工程技术进行的品质改良主要集中在改良种子贮藏蛋白、淀粉、油脂等的含量和组成上。其改良途径主要有:(1)将编码广泛氨基酸组成或高含硫氨基酸的种子贮藏蛋白基因导入植物,如将玉米醇溶蛋白基因导入烟草、马铃薯等以改善其蛋白质的营养品质等;(2)将某些蛋白质亚基基因导入植物,如将小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW)基因导入小麦以提高其烘烤品质等;(3)将与淀粉合成有关的基因导入植物,如将支链淀粉酶基因导入水稻以改善其蒸煮品质等;(4)将与脂类合成有关的基因导入植物,如将脂肪代谢相关基因导入大豆、油菜以改善其油脂品质等。目前已有经油脂改良的转基因大豆、油菜品种在美国获得商业化生产许可。1.7结构基因的构建杂种优势利用在农业生产中发挥着重要的作用,已在多种植物中取得了明显的增产效果。创造杂种优势的关键是选育雄性不育系及其恢复系,传统育种方法选育的雄性不育系多是利用野生雄性不育材料通过多代回交选择而成,不但选育时间长,较难获得农艺性状优良的雄性不育系,而且育成的雄性不育系遗传背景较为单一,其生产风险也不容忽视。植物基因工程技术的兴起为创造植物雄性不育系提供了新的策略和可能。由于迄今尚未克隆到效果明显的雄性不育基因,利用基因工程方法创造雄性不育多是采用特异性启动子与RNA酶基因构建嵌合基因这一策略来实现的。1990年,Mariani等开创性的研究工作为这一研究领域带来了全新的思路和方法,他们利用烟草花药绒毡层特异性启动子TA29与源于Bacillusamyloliquefaciens的RNA酶基因barnase拼接构建成嵌合基因TA29-barnase,导入烟草和油菜后获得了这两种作物的雄性不育基因工程植株。随后,又将RNA酶抑制基因barstar与TA29拼接构建成TA29-barnase基因的恢复基因TA29-barstar,该基因转化烟草和油菜后能使利用TA29-barnase基因创造的雄性不育植株的育性得以恢复。利用这一策略已在烟草、油菜、小麦、水稻和一些果树育种中获得了雄性不育植株。利用类似的方法,如采用花粉特异性启动子ps1替代TA29启动子、采用glucanase基因替代barnase基因等,在烟草、莴苣等植物中也获得了雄性不育植株。目前已有利用这一技术育成的玉米、菊苣雄性不育品系在美国获得了商业化生产许可。基于对花粉肌动蛋白的多年研究,最近有研究者提出将反义豌豆肌动蛋白基因与花粉/花药特异性启动子拼接构建“雄性不育基因”的策略,并在小麦、番茄中获得了初步成功,该领域的研究很可能为利用基因工程技术培育植物雄性不育提供一条新途径。1.8降低果实成熟及软化进程的基因果品的货架存放期将直接影响其商业价值,因此,人们非常希望利用基因工程技术来改变果品的熟性,目前已分离到几个控制果品成熟的专化基因,例如编码纤维素酶基因和多聚半乳糖醛酶基因,通过改变这些基因的表达,有可能改变果实的成熟特性,特别是将反义多聚半乳糖醛酶基因导入番茄后可明显降低其成熟时的软化进程,目前已有这种转基因番茄品种在美国获得商业化许可。另一种降低果实收获后成熟和软化进程的方法是干扰乙烯的合成,主要利用乙烯合成的前体-氨基环丙烷羧酸(Acc)的分解基因及Acc合成酶基因或乙烯合成酶基因的反义序列,这一方法也已在番茄等植物中获得了成功。另外,与植物发育相关的基因近年来也越来越受到人们的重视,如花发育基因、抗衰老基因等等,将这些基因导入植物后人们希望改善植物的生长发育状况,已有研究者利用反义RNA技术将冬小麦春化相关基因ver203导入冬小麦品系,并在一定程度上改变了其春化特性。1.9基因表达技术的应用鲜花外形、色泽及存活时间的改良将对年贸易额数10亿美元的鲜花产业产生巨大的影响。目前已可利用基因工程技术对类黄酮合成途径的有关酶进行操作来改变花色,而利用特殊启动子控制下的Mn-SOD基因过量表达增加内源氧的收集能力,也有望延长其保鲜期。目前已有改变花色的牵牛花品种在中国获得商业化许可。2通过基因改良措施在植物基因育种中的应用转基因技术作为一种创造变异的手段应该说仅仅只是育种工作的一个环节,要选育出能够在生产中推广应用的新品种仍然离不开常规育种技术手段的支持,目前商业化生产的转基因植物品种的选育过程都很好地说明了这一点。同时,由于转基因技术能够大大拓宽植物可利用基因库、使引发定向变异成为可能,给植物育种带来的变革也是极其深刻的,这至少表现在以下几个方面:首先,由于能够打破生殖隔离,使得转基因技术为拓宽植物可利用基因库创造了条件并提供了新的创造变异的技术手段。其次,用于基因工程育种的基因大多研究的较为清楚,改良植物的目的性状明确,选择手段有效,使引发植物产生定向变异和进行定向选择成为可能。第三,通过改良植物的某些关键性状,会使原推广品种在很大程度上得到提高,这不但可以大大缩短育种年限,而且可能在不同的生态区取得全面突破。第四,随着对基因认识的不断深入、新基因的克隆和转基因技术手段的完善,对多个基因进行定向操作也将成为可能,这在常规育种中是难以想象的,并且有可能引发新的“绿色革命”。就目前的植物基因工程育种实践来看,一些与常规育种不同的规律也应引起人们的足够重视,如由于外源基因失活、纯合致死效应、花粉致死效应以及其它一些未知的原因,会导致外源基因的遗传不符合孟德尔遗传规律;外源基因一般呈显性遗传给后代;有些转基因当代植株可能会由于组织培养方面的原因造成结实率降低,但其后代的结实率可望恢复正常;一些目标性状明确的基因导入植物后,由于插入位点的原因可能导致其它性状的变化等等;应注意具体问题具体分析。3基因表达产物针对转基因产品的安全性问题,科技工作者和媒体都已作了大量的报道,其讨论过的问题和对策不在赘述,现对转基因植物产品与传统植物育种品种在基因安全的等同性上发表一点看法。由于大量传统育种方法难以利用的