PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

实用文档PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析【实验目的】1.学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2.掌握群体遗传学基因频率与基因型频率的计算方法。【实验原理】1. 凝胶电泳是分离、鉴定、纯化及制备DNA片段最常用的方法，可分为两类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于lkb和大于lkb以上DNA；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用于小于lkb的DNA。琼脂糖凝胶电泳是一种简便易行的分离、纯化和鉴定DNA片段的方法。分为水平板和垂直板两种，一般采用水平电泳。2. 琼脂糖凝胶在DNA分子泳动时兼有“分子筛”和“电荷”的双重作用。3. DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。4. 由于琼脂糖凝胶具有网络结构，因此电泳时，带电颗粒的分离速度不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。5. 由于实验中相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极移动。6. 相对分子质量小者泳动快，大的泳动慢。7.溴化乙锭是分子生物学实验中常用的DNA荧光染料，含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍。所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5μg/mL）时，可以检测到少至10ng的DNA条带8.TBE（成分：Tris，EDTA，硼酸，蒸馏水）的作用：a.稳定体系酸碱度（正负极氧化还原反应，使正极变酸、负极变碱性）b.使溶液具有导电性，以利于DNA分子的迁移c.其中的EDTA螯合镁离子，防止电泳时激活DNA酶9.引物二聚体:引物二聚体是引物的3’端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。优化PCR的实验条件(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。11.LoadingBuffer指示剂溴酚蓝，可以显示电泳的进程；甘油成分增加样品密度，是样品密度大于电泳缓冲液，防止样品飘出点样孔。【实验过程及注意事项】（实验所用试剂及其作用）实验准备器材离心机、离心管、记号笔、移液器、移液器吸头、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外透射箱等。试剂0.5XTBE、上样缓冲液（loadingbuffer）、琼脂糖、溴化乙锭、DNAmarker等。材料PCR扩增产物。1.制备琼脂糖凝胶：用1%TBE150ml缓冲液（1×TBE）溶解2.25g琼脂糖，放入三角瓶中，微波炉加热煮沸(注意摇动时避免产生气泡)，待琼脂糖完全溶解后，冷却至60℃(不烫手)，加10ulEB，混匀、倒胶。2.制板：将胶倒入制胶板内，室温下充分凝固(约2h），竖直拔下梳子。将凝胶放入电泳槽内，加入缓冲液，没过胶面1~2mm。3.点样：（上样时要轻、稳、准、快）注意：1%TBE缓冲液没过胶面1~2mm，用移液器小心加入10ulPCR产物，留出5ulMarker的位置。4.电泳：接通电源，注意电极方向，电泳约25分钟。5.观察：取下琼脂糖凝胶，放置在紫外投射箱中观察。6.分析。注意事项1.电泳通常选择直流电源，电压在1-2V/cm，在25℃左右的室温中进行。2.温度过高会加速DNA分子扩散，使条带变宽、模糊。3.注意每个上样孔的载样量，太少会使条带不明显；太多则会造成条带拖尾。4.EB可以嵌入碱基分子中，导致错配。许多人认为溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性。不可以直接接触。5.拔梳子时候要垂直拔出。【实验结果与讨论】（上传琼脂糖凝胶电泳结果图片，是否得到电泳条带，并说明原因）本人得到了电泳条带,本班电泳条带比例为II型13人，ID型11人，DD型9人。本班内：I的基因频率为（13*2+11）/66=0.56;D的基因频率为0.44部分人没有得到条带，可能是以下原因：1上样液发生扩散飘移，而扩增浓度达不到，电泳结果不明显。2.DNA提取量太少，眼科剪未剪碎棉签头部，导致棉签头部过大，离心后吸取DNA提取液（上清液），造成了DNA提取液量比较少；3.也有可能是棉签刮擦力度不够，导致未得到电泳条带琼脂糖凝胶电泳结果图【思考题】某研究小组调查了某地区1000名无关个体ACE基因I/D的多态性分布，其中608名为II基因型，ID基因型个体的基因型频率为0.32，DD基因型个体38人，50人未检出，计算等位基因I与D的基因频率。50人未检出，即实际检出950人故：ID基因型人数：0.32*950=304人基因频率:群体中等位基因D的频率：p=(38x2+304)/1900=0.20群体中等位基因I的频率：q=(608x2+304)/1900=0.80答