动物细胞工程

是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。细胞工程：根据操作对象不同动物细胞工程植物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交动物细胞培养动物的核移植单克隆抗体动物细胞融合2.2.1动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养动物细胞培养：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。动物的细胞培养的理论依据（原理）？细胞增殖随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。动物细胞全能性的特点？细胞细胞群培养（动物细胞工程的基础）1、动物细胞培养的过程：动物胚胎或幼龄动物组织、器官剪碎用胰蛋白酶处理单个细胞有丝分裂制成细胞悬液10代细胞40~50代细胞无限传代（细胞群）胰蛋白酶（分瓶）原代培养传代培养加入培养液稀释动物胚胎或幼龄动物组织、器官用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理细胞团转入培养瓶中培养剪碎分裂能力强扩大细胞与培养液的接触面积。有利于细胞吸收营养。催化细胞间蛋白质水解制成细胞悬液加入培养液稀释分散成单个细胞有利于吸收营养有丝分裂在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁的要求：表面光滑、无毒、易于帖附。细胞贴壁：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成单层细胞，此时细胞间相互接触，细胞就会停止分裂增殖。（细胞分裂大约十代左右）细胞接触抑制：有丝分裂原代培养细胞悬液10代细胞胰蛋白酶分瓶有丝分裂胰蛋白酶原代培养传代培养细胞悬液10代细胞50代细胞无限传代原代培养：人们通常将动物组织消化后（形成单个细胞）的初次培养，一般培养的第1代细胞与传10代以内的细胞培养称为原代培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养。有丝分裂胰蛋白酶细胞株细胞系细胞悬液10代细胞50代细胞无限传代细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。1、动物细胞培养的过程：动物胚胎或幼龄动物组织、器官剪碎用胰蛋白酶处理单个细胞有丝分裂制成细胞悬液10代细胞40~50代细胞无限传代（细胞群）胰蛋白酶（分瓶）原代培养传代培养加入培养液稀释讨论2、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？答：不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。讨论1、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？答：10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。讨论3、动物细胞培养液的主要成分是什么？比较植物组织培养的培养基有何独特之处？2、动物细胞培养的条件：①无菌无毒的环境：②营养：③温度和pH：④气体环境：⑴培养液和培养用具无菌处理；⑵培养液中添加抗生素杀菌；⑶定期更换培养液以清除代谢产物。⑴液体合成培养基；⑵促生长因子、微量元素等营养物质；⑶还需加入血浆、血清等天然成分。⑴适宜的温度：36.5±0.5℃⑵适宜的PH值：7.2~7.4⑴95%O2有利于有氧呼吸、细胞代谢；⑵5%CO2是维持培养液的PH值。3、动物细胞培养技术的应用：①蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。②应用于基因工程主要用于作为受体细胞。③检测有毒物质④细胞的生理、药理、病理研究如用于筛选抗癌药物等。判断某种物质的毒性。4、动物细胞培养与植物组织培养的比较：比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞的增殖培养基固体合成培养基液体合成培养基培养基的成分营养物质、激素、蔗糖、琼脂等营养物质、葡萄糖、动物血清等培养结果培育成新的植株或组织培育成细胞系或细胞株培养的目的快速繁殖、培育无病毒植株等获得更多的细胞或细胞产物等取材植物幼嫩的部位或花药等动物胚胎或幼龄动物的组织、器官其他条件无菌操作，适宜的温度、pH等条件二、动物体细胞核移植技术和克隆动物克隆羊

——多利克隆（clone）：是指通过无性生殖而产生的具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。克隆动物：用核移植方法得到的动物。伊恩·韦尔穆特博士名字：多利（Dolly）性别：雌编号：6LL3出生日期：1996年7月5日出生地点：英国爱丁堡市罗斯林研究所缔造者：韦尔穆特及其领导的小组基因父亲：无基因母亲：一只芬兰多塞特白面绵羊线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊生育母亲：一只苏格兰黑脸羊子女：生育6名，存活5名死亡日期：2003年2月14日死亡原因：被确诊患进行性肺病后处以安乐死资料档案将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。动物细胞核具有全能性细胞分化程度高，恢复全能性困难。体细胞核移植：胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易。1、动物核移植的概念：2、动物核移植的原理：3、动物核移植的分类：4、克隆动物那么多，为什么多莉举世闻名呢？在体细胞克隆羊多莉培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，多莉的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但是这并不能降低多莉诞生的重大意义。因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大的进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性。5、体细胞的核移植过程：供体细胞培养大量的供体细胞重组细胞构建重组胚胎代孕奶牛C克隆高产奶牛胚胎移植卵母细胞培养卵母细胞去核电刺激高产供体奶牛A受体奶牛B①②③④⑤⑥⑦⑧电刺激6、核移植的流程：①、供体细胞的采集与培养。⑤、用电刺激使两个细胞膜相融合就构建成重组细胞。⑥、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程，形成重组胚胎。④、将供体细胞注入去核的卵母细胞中。③、显微操作去除卵母细胞中的核。②、受体卵母细胞的采集与体外培养。⑦、将胚胎移入代孕母牛体内。⑧、生出与供体遗传物质基础相同的犊牛。讨论⒈在体细胞的细胞核移植到受体卵细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？讨论⒉用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？答：为了使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的体细胞。答：10代以内的细胞保持正常的二倍体核型。讨论⒊细胞核移植生产的动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？答：不是。大部分DNA来自供体的细胞核，还有少数DNA来自受体细胞的线粒体。8、体细胞核移植技术的应用前景：①、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程，促进优良畜群繁育；②、保护濒危物种，增大存活数量；③、生产许多珍贵的医用蛋白质；④、作为异种移植的供体；⑤、用于组织、器官的移植等。7、核移植的特点：主要是指不同种的细胞的拆合，新个体具有双亲的遗传特性。但其核遗传物质来自供体细胞。9、体细胞核移植技术存在的问题：②、克隆技术的各个环节有待进一步改善。①、体细胞核移植技术成功率非常低。③、绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷。如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷、免疫失调等。④、对克隆动物食品的安全性问题有争论。⑤、生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一段距离。2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体三、动物细胞融合1、动物细胞融合的概念：是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。细胞杂交：不同基因型的细胞之间融合的过程就是细胞杂交。杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。2、动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性。生物方法：灭活的仙台病毒。（病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。）化学方法：聚乙二醇（PEG）

物理方法：离心、振动、电激3、动物细胞融合的方法：动物A细胞动物B细胞融合的原生质体AB杂交细胞AB（筛选）有丝分裂两个完整的杂交细胞灭活的病毒4、动物细胞融合的过程：6、动物细胞融合的意义：①、突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。②、是研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种的重要手段。③、为杂交瘤细胞技术发展与单克隆抗体的制备开辟了新途径。5、动物细胞融合的特点：动物细胞融合包括细胞准备、细胞融合、杂种细胞选择、杂种细胞克隆。与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导方法相类似。项目动物细胞融合植物体细胞杂交原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性和植物细胞的全能性融合前提分散成单个细胞去除细胞壁诱导方法聚乙二醇、离心、振动、电激、灭活病毒聚乙二醇、离心、振动、电激、结果获得杂种细胞或细胞产物获得杂种植株用途制备单克隆抗体培育作物新品种意义克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍7、动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：四、单克隆抗体1、单克隆抗体的概念：由单个效应B细胞（浆细胞）进行无性繁殖，形成细胞群。由这样的细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体。2、血清抗体与单克隆抗体的区别：名称血清抗体单克隆抗体产生向动物内反复注射某种抗原，然后从中分离抗体由杂交瘤细胞分泌特点产量低、纯度低、特异性差特异性强，灵敏度高，能大量制备3、单抗的制备原理：①免疫原理：效应B细胞产生特异性抗体。②动物细胞融合：利用病毒对宿主细胞的穿透性使效应B细胞与骨髓瘤细胞融合。③动物细胞培养：对杂交瘤细胞进行筛选，体外的培养大量增殖，以获得所需抗体。B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞单克隆抗体诱导细胞融合第一次筛选第二次筛选动物细胞融合技术动物细胞培养技术体内培养抗原4、单克隆抗体的制备过程：体外培养从腹水中提取从培养液中提取细胞免疫注射脾脏注入腹腔内培养液用选择培养基进行筛选杂种细胞。首先，细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。人的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。小鼠的骨髓瘤细胞中只有D途径，但能不断地分裂增殖。将这两种细胞在培养基中混合，加聚乙二醇促融，然后在培养液中加入氨基蝶呤进行选择。第一次筛选：（选择杂交瘤细胞）细胞合成DNAD途径D途径S途径骨髓瘤细胞B淋巴细胞通过第一次筛选，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程为杂交瘤细胞的克隆化培养。第二次筛选：（克隆化培养和抗体检测）4、单抗隆抗体的应用：①作为诊断试剂用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。②定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病利用同位素标记单抗，在特定组织成像。③用于治疗疾病和运载药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素（HCG），是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。

早孕试纸其实是利用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体作为配体，固定在层析柱上，以胶体金为指标，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否怀孕。阳性：出现两条红色条带表示已怀孕。一条是对照区C，一条是检测区T。阴性：仅有对照区C条带，而检测区T无条带，表示未怀孕。无效：对照区C无条带。甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为抗原免疫小鼠，制备抗AFP单克隆抗体，并与含放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过全身血液渗透到所有组织。由于肿瘤细胞表面的AFP会和单克隆抗体特异性结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在肿瘤上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。5、定位诊断肿瘤：用癌细胞作为抗原，免疫小鼠，制备抗癌细胞单克隆抗体，并与抗癌药物连接，便制成了生物导弹，注入患者体内，借助单克隆抗体的导向作用，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了药剂的用量。6、生物导弹-----结合同位素的单抗单克隆抗体放射性同位素抗癌药物动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术。动物细胞工程小结：1、动物细胞培养；2、动物体细胞核移植技术和克隆动物；3、动物细胞融合；4、单克隆抗体。总结1、总结本节课的主要内容；2