备课素材：核酸分子杂交 第一学期高中生物学选择性必修三

核酸分子杂交核酸分子杂交是指两条具有互补序列的核酸单链在一定条件下按碱基配对的原则形成双链的过程，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子或杂交双链，杂交的双方是探针与待检测序列。利用DNA变性与复性的基本性质，分子杂交技术结合印迹技术和探针技术，目的是为了进行DNA/RNA定性或定量的分析。一、印迹技术在杂交反应前，常需要采用琼脂糖等凝胶将不同分子量的核酸分离，然后进行杂交反应。但是凝胶易碎，不便操作，难以直接在凝胶上完成后续的杂交反应。（就是先跑琼脂糖凝胶电泳，将不同分子量的核酸进行区分；但是由于凝胶易碎，不能在凝胶上直接进行后续的杂交反应）1975年，E.Southern将琼脂糖电泳分离的DNA片段在胶中进行变性（用了一些引起DNA变性的化学试剂），然后将一张硝酸纤维素（NC）膜放在胶上，膜上放上吸水纸巾，利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。（这里可能就是在胶上先加DNA变性试剂，盖上一层NC膜，在膜上再放一个吸水纸，水可通过NC膜被吸到吸水纸上，水分子被转移的同时，把DNA片段粘附在了NC膜上）载有DNA单链分子的NC膜就可以在杂交液中与另一种DNA/RNA分子（称为探针，可用同位素标记）进行杂交。具有互补序列的RNA或DNA探针结合到NC膜的DNA片段上，经过放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和其位置。常用的转印方法主要有：毛细管虹吸转移法；电转移法；真空转移法1.毛细管虹吸转移法原理：容器中含有高浓度的NaCl和枸橼酸钠的转移缓冲液，上层吸水纸通过虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、NC膜向上运动，带动凝胶中的DNA片段垂直向上转移到膜上。毛细管虹吸转移法转移效率不高，尤其对分子量较大的DNA片段。但由于器械简单，转移效率对Southern杂交已足够，一直被使用。2.电泳转移法此方法是通过电泳原理将凝胶中的DNA转移到膜上。原理：用有孔海绵和有机玻璃板将滤膜与凝胶夹贴在一起，放到盛有缓冲液的电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极（为啥？）。在电场作用下，凝胶中的DNA片段沿与凝胶垂直的方向泳动，滞留在滤膜上，形成印迹。（转移到滤膜上的DNA片段就叫印迹）电泳转移法适用于大片段DNA，但不宜选用硝酸纤维膜（NC膜）；电泳的缓冲液也不能用高盐的，避免产生强电流破坏DNA。常用的转移法有湿转和半干转。湿转是将胶/膜浸入缓冲液然后加电压；半干转是用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽，半干转比湿转快。3.真空转移法原理：此方法是以滤膜在下、凝胶在上的方式，利用真空泵将转移液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空中，同时带动核酸分子转移到凝胶下面的硝酸纤维素膜或尼龙膜上。真空转移法可以在转膜的同时进行DNA的变性和中和，一般先用变性液转移15～30分钟，再换用中和液转移15～30分钟。真空压力不要太大，否则凝胶被压缩，转移效率低；真空仪器密闭性良好，防止漏气核酸样品多采用毛细管虹吸转移法，也可采用真空转移；蛋白质样品采用电转移二、探针技术探针：在核酸分子杂交体系中，杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列，已知核酸序列又称为探针（probe）。探针的功能：（1）带有可检测标记（2）探针需要事先设计且已知序列，通过与转移膜上的核酸杂交，获得或判断代检测核酸样品的相关信息。探针的种类：（1）cDNA探针(complementaryDNA）通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒使cDNA得到大量扩增。提取质粒后，用限制酶消化重组质粒，将cDNA片段切割下来，分离纯化，即可作为探针使用。（目前cDNA探针应用最广泛）（2）基因组DNA探针从基因组文库中筛选获得一个特定基因的克隆，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化，即可作为探针使用。（3）寡核苷酸序列根据已知的核酸序列，人工合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。（4）RNA探针采用基因克隆和体外转录的方法得到RNA作为探针。探针的标记（1）放射性标记（高特异性，半