实验三 比重与染色检验

实验三植物病原比重与染色检测2013.3.10实验原理根据受害种子和健康种子比重不同，用一定浓度的溶液加以区分；利用不同种类的化学药剂对植物及其产品的某一组织进行染色，然后再根据植物组织颜色的变化来判断植物体是否感病。实验目的熟悉并掌握比重检验方法和常见真菌、细菌、病毒染色检验的方法。仪器及试剂实验目的显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、烧杯、解剖针、酒精灯、接种环、三角瓶、恒温箱、水浴锅。去离子水、甲酰胺、1moL/LNaOH、二甲苯、0.5%过碘酸待检植物病组织或病粒、待检病原物方法与步骤（一）比重检验将供试的样品放入事先准备好的清水或溶液中，种子与溶液的容积比是1：5，用玻璃棒充分搅拌后计时，按照预定的静置时间，捞出上层漂浮种子，分别放在培养皿里，再进行剖粒检查。（二）染色检验1.磷酸酶染色法（真菌）用病组织（如患有黑斑病的甘薯块）切成薄片；或取已经变褐的待检病组织（如有病斑的病叶），用镊子剥取其表皮。组织用10%甲醛固定，去离子水冲洗两次，将切片在试剂中于37度浸泡60min，再用去离子水冲洗两次，2%黄色硫化氨溶液浸泡1min，再用去离子水洗2次，最后镜捡。在酶活存在的部位有黑色硫化铅沉淀。方法与步骤2.过碘酸Schiff染色（简称PAS、PASH或糖原染色）（真菌）真菌细胞壁含有多糖，过碘酸使糖氧化成醛，再与品红-亚硫酸结合而成为红色，故菌体染成红色，核为蓝色，背景为淡绿色。组织切片先用二甲苯脱脂及95%乙醇逐级脱水；浸于0.5%过碘酸溶液5min，蒸馏水冲洗2min；将切片浸入碱性复红或Schiff液中15min，自来水冲洗至切片发红；亮绿复染5s，95%乙醇脱色一次，再用无水乙醇脱色2次，二甲苯透明2次；封片，镜捡。方法与步骤3.噬银染色（GMS）（真菌）原理与2类似，用铬酸代替过碘酸。结果是真菌染成黑色，菌丝内为旧玫瑰红色，背景为淡绿色。组织切片先用二甲苯脱脂、无水乙醇、95%乙醇、蒸馏水各脱脂2次；浸于5%铬酸溶液中氧化1h后自来水冲洗15s；1%亚硫酸氢钠溶液处理1min，用自来水冲洗10min；蒸馏水冲洗3次后置染色液中染色30-40min（60度）；蒸馏水洗涤5-6次，加0.1%绿化金溶液褪色2-5min，再用蒸馏水洗涤；加2%硫代硫酸钠处理2-5min，水洗，加0.1%亮绿复染40s；依次加95%乙醇、无水乙醇各脱水1次，二甲苯清洗2-3次；封片，镜捡。方法与步骤4.荧光染色组织切片用铁苏木紫染色5min，使背景成黑色；水洗5min后用0.1%吖啶橙染色2min，水洗后用95%乙醇脱水1min，再用无水乙醇脱水2次，每次3min；最后二甲苯清洗2次，用无荧光物质封片，镜检。方法与步骤5.KOH溶液脱色（真菌）一般脱色法对一些暗色的病部组织，为更好的镜检，把病部切成5mm见方的细片，置于19%KOH溶液或3%高锰酸钾溶液中煮沸2-5min，组织中菌丝染成深色而其他组织脱色或成浅色，镜检。组织透明法从老斑周围剪取若干小块于小烧杯中，加入适量10%KOH（或其他叶片组织透明剂），煮沸5-10min至组织透明，加0.05%苯胺蓝（棉兰）乳酚油做浮载剂，检查有无卵孢子。如烟草霜霉病方法与步骤6冰冻匀浆法（真菌）取可疑病斑或叶片（直径1cm）0.1g，加磷酸缓冲液（pH7，PBS）2mL，搅拌，在室温下静置15min，然后与-18度速冻2h，将冰冻叶片置于匀浆器内，加1-2mLPBS，匀浆4-6min，孔径为60um的不锈钢网摔筛过滤并不断冲洗，收集滤液，以1000r/min离心3min，弃上清，加乳酚油定容至1mL，记录卵孢子数，如烟草霜霉病。方法与步骤7.品红染色法（真菌）将病组织于蒸馏水中浸泡30min，滴1滴上层液置于载玻片上，加1滴0.1%升汞或1%锇酸液固定，使其干燥，再加1滴1%酸性品红或3%甲紫染色1min，然后用水冲洗，镜检孢子。如马铃薯癌肿病（单鞭毛游动孢子或双鞭毛接合子）方法与步骤8氧化酶染色法（病毒）剥取包括病斑部的病叶表皮或是将病斑部的病叶切成小片直接供实验，将表皮或组织在37度下浸泡60min，用去离子水洗涤，镜检或肉眼观察，病斑部周围为黑褐色，如菜豆病毒病。方法与步骤9多酚体染色法（病毒）落叶果树（感染病毒后病组织内常积累多酚体，与NaOH反应显现深蓝色）叶片剪开或嫩枝/根切成薄片投入乙醇甲醛液中，80度水浴使组织褪色，可更换乙醇甲醛溶液使绿色完全褪去；褪色后的组织置于1mol.L-1NaOH中，80-100度水浴使其充分显色；感染病毒的（有多酚体）呈深蓝色，无多酚体时呈黄色。方法与步骤10革兰氏染色反应（细菌）通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复