基因的体外重组课件

基因的体外重组基因的体外重组MajorgroupProkaryotic/eukaryoticTypeExamplesBacteriaProkaryoticGram-veEscherichiacoliGram+veBacillussubtilisStreptomycesspp.FungiEukaryoticMicrobialSacchromycescerevisiaeFilamentousAspergillusnidulansPlantsEukaryoticProtoplastsVarioustypesIntactcellsVarioustypesWholeorganismsVarioustypesAnimalsEukaryoticIntactcellsDrosophilamelanogasterMammaliancellsVarioustypesOocytesVarioustypesWholeorganismsVarioustypesIHostCells:Typesofhostcellusedforgeneticengineering复制型受体菌株DH5αDH5α是一种常用于质粒克隆的菌株。其φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1F-：F因子缺失φ80dlacZΔM15：lacZM15是表达β－半乳糖苷酶α片段的一段基因。当M15缺失（ΔM15）时，lacZ基因虽然能表达ω片段，但不能表达α片段，β－半乳糖苷酶没有活性。当使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。Δ(lacZYA-argF)U169,deoR：指lacZYA到argF之间的deoR基因，大约100,000bp。deoR是大肠杆菌中deo操纵子的调节基因，它表达的阻遏蛋白对deo操纵子具有重要的调控作用。基因的体外重组deo：deo操纵子位于大肠杆菌基因图谱100

min

的位置，它含有deoA、deoB、deoC

和deoD等结构基因，分别表达DNA代谢所需的酶类，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸转位酶、脱氧核糖磷酸醛缩酶和嘌呤核苷磷酸化酶。deoR基因的变异，使deo操纵子的阻遏蛋白不能表达，宿主细胞合成大量的dCTP，可以选择性地改善大分子DNA的转化。recA1：recA

(Recombination)减少克隆DNA的非特异性重组

。recA基因表达ATP依赖型DNA重组酶，它在λ噬菌体与基因组DNA的溶原重组时起作用，同具有对DNA放射性损伤的修复功能。由recA基因的变异所产生的基因型使源或异源DNA的重组不能进行，保持插入DNA的稳定性，对DNA的转化有利。一个菌株的基因型如果是recA，则说明此菌株的表现型是重组缺陷的。

endA1：endA1，endA

(Endonuclease)无Endonuclease

I酶活性，有利于质粒的纯化。endA基因表达非特异性核酸内切酶，它能使所有DNA双链解开，在DNA的复制和重组中起重要作用。endA基因的变异将使插入的外源DNA更加稳定，提取的质粒纯度更高。hsdR17(rk-，mk+)：限制缺陷，修饰正常可使DNA甲基化，但不限制外源DNA。hsdR

(Host

specificity

defective)

hsdR基因表达I型限制酶EcoK(K12株)或EcoB(B株)，在大肠杆菌细胞中起到一种“抗体”的作用，对外来的各种DNA有严格的限制。HsdR基因的变异导致菌株基因的体外重组

细胞内的I

型限制酶EcoK或EcoB活性缺失，这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。hsdS20(rB-、mB-)，其中S20代表特异性识别蛋白发生变异，()中的

rB-、mB-表示由于S20的变异而导致B株来源的hsdR和hsdM的功能缺失。phoA，supE44，supE

(Suppressor)

功能：supE基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合，使蛋白质合成停止。supE基因发生变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密码子UAG，蛋白质合成仍能继续，并使UAG作为一个密码子来编码谷氨酰胺（Glutamine），从而使发生了琥珀突（AAG→UAG）的基因对蛋白质表达得以延续，因此称supE为琥珀突变抑制因子。supE44（sup基因座E的44位突变）。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。

λ-，thi-1

功能：thi(thiamine)基因包含有thiA、thiB、thiC、thiD、thiK、thiL等。thiA表达硫氨素噻唑转运蛋白、thiB表达硫氨素磷酸盐焦磷酸化酶、thiC表达硫氨素嘧啶转运蛋白、thiD表达磷酸甲基化嘧啶激酶、thiK表达硫氨素激酶、thiL表达硫氨素甲磷酸激酶。thi的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（VB1），细胞才能正常生长。硫胺素代谢突变在基本培养基上的生长需硫胺素的存在。基因的体外重组

gyrA96，gyrA（Gyrase）

功能：gyrA基因表达DNA促旋酶A亚基。DNA促旋酶在DNA复制时具有使DNA解旋和回旋的作用。萘啶酮酸

(Nalidixic

acid)、4-喹啉（4-Quinoline）等抗生素抑制DNA促旋酶的活性是通过与促旋酶复合体(A2B2)中的A亚基的结合实现的。gyrA基因的变异使DNA促旋酶A亚基不能正常表达，萘啶酮酸和荧光喹啉等失去结合目标，从而使该基因型的菌株具有了对萘啶酮酸（Nalr）和荧光喹啉的抗性。relA1

relA（Relaxed）

功能：relA是松弛调节基因（还记得“魔斑”吗），对RNA的合成具有调节抑制作。同时relA基因还表达ATP：GTP3'-焦磷酸转移酶，负责在氨基酸饥饿状态下鸟苷3'，5'-二磷酸

(ppGpp)的合成，以适应饥饿环境。relA基因的变异对目的基因的转录有利。基因的体外重组IIVectors1.PlasmidVectors

Propertiesofsomenaturallyoccurringplasmids基因的体外重组PlasmidSize(kb)ConjugativeCopynumberSelectablemarkersColE17.0No10-15E1immRSF10309.3No20-40AprCloDF1310.0No10DF13immpSC1019.7No1-2TcrRK642Yes10-40Apr,SmrF103Yes1-2---R1108Yes1-2Apr,Cmr,Smr,

Snr,KmrRK256.4Yes3-5Apr,Kmr,TcrPlasmids:smallercirclesofDNAthatdonotcarryessentialgenesAmp(Ap)---ampicillinCm---chloramphenicolKan(Kn)---kanamycinHg---mercurySm---streptomycinSn---sulfonamideTet(Tc)---tetracycline基因的体外重组TherequirementsofartificialplasmidSmallDNAmoleculesOriginofreplicationSelectablemarkersUniquerestrictionenzymerecognitionsiteStable基因的体外重组ArtificialllyCloningVectors基因的体外重组PstIPvuISalI4.3kbpBR322oriCloningvectorpBR322基因的体外重组FrompBR322topAT153基因的体外重组MapofplasmidpUC118/19基因的体外重组Shuttlevector基因的体外重组Somecommerciallyavailableplasmidvectors基因的体外重组VectorFeaturesApplicationsSupplierpBR322Apr,TcrSinglecloningsiteGeneralcloning&sub-cloninginE.coliVariouspAT153Apr,TcrSinglecloningsiteGeneralcloning&sub-cloninginE.coliVariouspGEMTM-3ZAprMCSSP6/T7promoterslacZα-peptideGeneralcloning&invitrotranscriptioninE.coliandmammaliancellsPromegapCITMAprMCST7promotersCMVenhancer/promoterExpressionofgenesinhumancellsPromegapCMV-ScriptTMNeorLargeMCSCMVenhancer/promoterExpressionofgenesinmammaliancellsCloningofPCRproductsStratagene2.Bacteriophagevectors

StructureofbacteriophagesλandM13基因的体外重组MapofthefilamentousPhagevectorM13mp18基因的体外重组Mapofthephageλgenome基因的体外重组Lifecycleofphageλ基因的体外重组

Insertionandreplacementphagevectors

基因的体外重组Bacteriophageλinsertionvector

λgt10andCharon16A

基因的体外重组BacteriophageλreplacementvectorEMBL4andCharon40

基因的体外重组BacteriophageλreplacementvectorEMBL3/4基因的体外重组3.Thecosmidvector基因的体外重组Somecommerciallyavailablebacteriophage-bacedvectors基因的体外重组VectorFeaturesApplicationSupplierλGT11λinsertionvectorInsertcapacity7.2kblacZgenecDNAlibraryconstructionExpressioninsertsVariousλEMBL3/4λreplacementvectorsInsertcapacity9-23kbGenomiclibraryconstructionVariousλZAPExpressTMλ-basedinsertionvectorCapacityof12kbInvivoexcisionofinsertsExpressionofinsertscDNAlibraryconstructionAlsogenomic/PCRcloningStratagenλFIXTMIIλ-basedreplacementvector,capacity9-23kbSpi+/P2selectionsystemtoreducenon-recombinantbackgroundGenomiclibraryconstructionStratagenpBluescriptTMIIPhagemidvectorProducessingle-strandedDNAInvitrotranscriptionDNAsequencingStratagenSuperCosTMCosmidvectorwithAprandNeormarkers,PlusT3T7andSV40promotersCapacity30-42bpGenerationofcosmid-basedgenomicDNAlibrariesT3/7promotersallowend-specifictranscriptstobegeneratedforchromosomewalkingtechniquesStratagenSomepossiblevectorsforplantandanimalcells基因的体外重组CellTypeVectorTypeGenomeExamplesPlasmidDNATiplasmidofAgrobacteriumtumefaciensViralDNACauliflowermosaicvirus,GeminvirusesRNATobaccomosaicvirusAnimalcellPlasmidDNAVarioustypesofplasmidvectorareavailable.ManyarehybridvectorscontainingpartoftheSV40genomeViralDNABaculovirusesPapillomavirusesSimianvirus40(SV40)VacciniavirusViralRNARetrovirusesTransposonDNAPelementsinDrosophilamelanogster4.Artificialchromosomevector基因的体外重组Mapoftheyeastartificial

chromosomevectorpYAC4基因的体外重组MapofthebacterialartificialchromosomevectorpBeloBAC11基因的体外重组IIICloningStrategies

基因的体外重组基因克隆策略cDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingDirectchemicalsynthesisBlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolymertailingLigationofcohesiveterminiTransformationwithrecombinantplasmidDNATransformationwithrecombinantplasmidDNAPackagingDNA

invitro

a.Directional

cloning

usingvector

pUC118-119

基因的体外重组基因克隆策略Directional

cloning

usingvector

pUC119

基因的体外重组基因克隆策略CloninginM13vectors基因的体外重组b.DirectlycloningofPCRproducts

基因的体外重组

5’5’HindIIIEcoRIHind

IIIEcoRICTTAAGCCGGGAATTCGGCCCGCGTTCGAAGCGCAAGCTTDegeneratePrimerPCR

SelectingthesequenceaminoacidsequencePhe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Pro

numberofcodons26

4

64214224peraminoacidavoidbettersequence(b)MixedprobesynthesisAlaLysTrpAlaTyrAspProGCAAAATGGGCATACGACCCGGGTTCCTTNumberofpossibilities4x2x1x4x2x2x1=128

Usinginosineasthedegeneratebase

AlaLysTrpAlaTyrAspProGCIAAATGGGCITACGACCCGTT

Numberofpossibilities1x2x1x1x2x2x1=8基因的体外重组DegeneratePrimerPCR

基因的体外重组c.CloningSau3AfragmentsintoaBamHIsite

基因的体外重组

(a)BamHI5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’Sau3AI5’-NGATCN-3’

3’-NCTAGN-5’(b)BamHI(vector)GATCCCCTAGGG(c)Sau3AI(insert)CTAGCTAGGATCGATC(d)CTAGGGGATCCCTAGGATCCAnnealVectorInsertVectorLigationofSau3A-cutDNAinto

theλReplacementVectorEMBL4

基因的体外重组基因克隆策略d.UseofLinkers5’-CCGAATTCGG-3’3’-GGCTTAAGCC-5’

基因的体外重组基因克隆策略GGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGDNAligaseEcoRIGCC5’-AATTCGGGGCTTAA-5‘CCGCloningcDNAinλVectorUsingLinkers

基因的体外重组基因克隆策略StrategyemployedinusingphageLambdaasacloningvector基因的体外重组e.UseofAdaptorsOHGATCCCCGGG

+

GGGCCC

基因的体外重组基因克隆策略OHGATCCCCGGG

GGGCCCGGGCCC5’-OHGATCCCCGGGGGGCCCCTAGOH-5‘CCCGGGDNAligasef.HomopolymerTailing

基因的体外重组基因克隆策略g.AdvancedCloningStrategies(1)

基因的体外重组基因克隆策略AdvancedCloningStrategies(2)