代谢病研究常用实验技术

代谢病研究常用实验技术常用实验技术简介样品中维生素D的含量测定无创血压测量系统实时定量PCR技术尤斯灌流室系统膜片钳系统介绍CNV维生素D的含量测定维生素D简介功能性维生素D主要包括D3和维生素D2。维生素D除了具有传统意义上的骨骼效应，它还有着广泛的非骨骼效应，与心血管疾病，免疫疾病，糖尿病，肿瘤等疾病密切相关。25-羟基维生素D（25HD）的测定是衡量维生素D营养状态的最佳指标。根据测定原理不同，目前25HD的测定方法有:放射免疫法(RIA)——灵敏度高、特异性强、精密度好、仪器设备条件要求不高。是基层单位对超微量物质测定的主要手段。但存在放射污染的潜在风险。酶联免疫吸附实验(ELISA)——仪器设备操作简单无污染但灵敏度和特异性低。是目前实验室较常用的检测方法。化学发光免疫测定(CLIA)——操作简单，快速且容易自动化，现已有多家厂商开发出相关自动免疫分析仪。25HD的测定方法:4.高效液相色谱法(HPLC)——灵敏度、特异性、准确性都较高，但设备较贵且标本前处理过程复杂。4.液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)——灵敏度、特异性、准确性都高但操作程序较复杂且需要更昂贵的特殊仪器。ELISA法检测原理标准品、质控品和样本被标记有25羟基维生素D

的生物素稀释。稀释后的样品在包被了高特异性羊

25羟基维生素D抗体的微孔中室温孵育2小时后，加

入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白并有选择的

与复合生物素结合，再利用底物显色。利用酶标板

读取吸光度，颜色强度与25羟基维生素D浓度成反比。维生素D的含量测定临床血液样品的制备与分组

血液中维生素D的检测：应用25羟基维生素D酶免疫试剂盒定量测定人体血清或血浆中的25羟基维生素D和其他羟基化的代谢产物检测结果的分析方法临床血液样品的制备

全血样品采集完毕待自然凝固后放置4～8℃环境中过夜，8000转离心4分钟，取上清液置于新离心管内。合格血清标准血清质量性状要求外观清亮流动性较好。血清应未腐败（新鲜）、无溶血、透明（无明显沉淀物）、无杂质、未凝固或未完全凝固、体积足够检测与样品备份。血液中维生素D的检测检测结果的分析方法绘制标准曲线：在半对数坐标纸上做出一条校准曲线（以B/B0%为纵坐标，25-OH-VitD浓度为横坐标）。每个待测样本都计算B/B0%并且读数，在标准曲线上找对应的25-OH-VitD浓度值。介绍CNV无创血压测量系统无创血压测量系统的操作方法动物血压采集原理鼠模型的确立与分组血压采集器的操作采集数据的分析传统的血压计测量小动物血压：被测量的小鼠无法适应造成血压值不具有代表性；血压产生的振动波微弱很难检测到或是夹杂噪音；小鼠在测量过程中骚动破坏了测量过程。无创血压测量系统简介无创血压测量装置和系统用于慢性实验中动物动脉血压的观测,动物不需麻醉、无创伤、使用方便。采用国际上流行的尾袖法无创测量血压原理，适用的动物包括大、小白鼠、猫和狗等。无创血压测量系统测量原理与人体手臂血压测量方法相似。即通过对动物肢体或尾部加压，阻断其血压，以不能记录肢体或尾部脉搏为准；然后逐渐减压，当尾部重新出现脉搏波时（即内外压相等时）获得动物的收缩压；继续减压，直至脉搏波逐渐增至最大，得到动物的舒张压。无创血压测量系统特点全自动的无创血压测量过程：系统自动充放气，自动实时测量并存贮测量结果；一次可同时测量6只大鼠血压，大大提高了实验人员的工作效率；测量多项无创血压生理指标，包括：收缩压、舒张压、平均压、心率等；方便的测量方式和测量数据的导出。无创血压测量系统组成该系统由通用8道生物机能实验系统、BP-6A恒温箱、鼠尾脉搏探测和阻断器、大鼠固定笼以及

BP-6A服务器构成。8通道信号采集系统通用8道生物机能实验系统不仅可以完成无创血压测量功能，还可记录其它生物信号，如张力、心电等，大大拓宽了该系统的适用范围。BP-6A恒温箱为最多6只大鼠同时提供恒温环境，同时减少实验动物的外界干扰。该箱体内嵌微电脑控制系统，可以自动控制血压测量过程中的充放气，鼠尾脉搏信号的转接和传送等。BP-6A恒温箱控制面板。鼠尾脉搏探测和阻断器一体化鼠尾脉搏探测器和鼠尾脉搏阻断器，其中探测器用于获取鼠尾正常脉搏信号，而阻断器用于阻断尾部正常脉搏信号。BP-6A系统的其它附件包括：大鼠固定器，

USB连线，信号连接线等。无创血压测量系统操作步骤（1）使用专门的连接线连接加热箱控制面板上的脉搏传感器输出口与动物无创血压采集系统8道系统；将传感器上的接头插到对应机箱内的连接器接头上，将进气口的气管连接在机箱内对应的充气口接口上。将动物血压测量系统通过USB连接线连接到电脑上，打开软件，进入到软件界面。打开BP-6A的电源，系统开始进行加热，设定实验所需的加热温度，一般情况设置为36℃。无创血压测量系统操作步骤（2）将大鼠放入鼠笼内固定（注意一定要保持大鼠腹壁向下）固定好后将其整体放入加热箱内。将大鼠鼠尾穿过传感器，并尽可能将传感器置于鼠尾根部在无创机箱后覆盖一层厚的深色窗帘，减小光线对大鼠的影响。从实验项目菜单中选择“无创血压测量”命令，选择工具条上“启动实验”按钮，软件界面中即有信号出现。无创血压测量系统操作步骤实验开始后，老鼠需要20min才能出现稳定波形。待出现稳定的脉搏波后，按下机箱控制面板上的“启/停键，系统开始按照设定的参数对大鼠尾部血流进行加压阻断，调节增益得到最佳的阻断波形。系统默认的加气阻断时间为10min，可根据实验要求更改但最少不能短于1min。达到设定时间后，系统会自动停止运行或者按“启/停”键停止实验，将波形保存以供分析。无创血压测量系统注意事项实验中应尽量将传感器放置在鼠尾根部；必须对大鼠进行正式实验前的训练；实验过程中应尽量减少打开机箱门的次数；如果实验的大鼠少于

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只，应该用橡胶塞将未使用通道的充气口阻塞。实验过程当中应保持安静。介绍CNV实时定量PCR技术（

Realtime

Quantitative

PCR

）PCR（Polymerase

Chain

Reaction）技术的产生In

1983,

Kary

Mullis

invented

a

process

he

called

PCR,which

solved

a

core

problem

in

genetics:

How

to

makecopies

of

a

strand

of

DNA

you

are

interested

in.PCR技术的应用“…真正惊人的是PCR完全不是为解决某一个问题而设计的，该技术成熟之后，它所能解决的问题才开始涌现…”——史蒂文·沙夫定性（基因突变、基因分型等、甲基化检测等）定量（基团拷贝数差异、基因表达，不同组织，不同时间，不同处理）Realtime-PCR的产生、原理实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出。实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团利用扩增过程中荧光信号随产物累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。与普通PCR相比优点特异性好（Taqman法），使用特异性探针对定量分子进行识别，靶序列由引物和探针双重控制。线性范围宽，即使模板量很小也能获得较为准确的检测结果。操作简单，省去纯化、电泳等产物后处理过程，高通量。确保取值点处于指数增长期Realtime-PCR的类型染料法探针法根据方法SYBR

Green（染料实法）验情况和条件Tagman

（探针法选）择合适的性质可逆荧光积累荧光融解曲线分析能不能特异性引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）引物+探针探针不需要需要通用性通用专用成本较低较高方法（2-

△△Ct）样本1的待测基因样本2的待测基因样本1、2的参照基因待测基因(Ct)参照基因(Ct)正常样相本对A定量计B算病人样本CD样本1-正常样本样本2-病人样本调查待测基因在病人样本中的表达与在正常人相比有何差别。表达量=2-[(C-D)-(A-B)]表达量>1，表达上调表达量<1，表达下调RT-PCR实验过程中应注意的问题RNA质量：完整性、纯度反转录引物选择PCR引物的设计加样前准备工作RNA质量OD260/280在1.9-2.1之间纯度最好小于1.8，表明蛋白杂质较多大于2.2，表明RNA已经降解反转录引物选择Oligo

dT要求RNA必须有Poly

A，适用于真核生物。适合长链、全长RNA的RT，对RNA样品质量要求较高，不能有断裂。Random

Primer适合各种RNA的RT，尤其是丰度低的模板和具有复杂二级结构的模板。PCR引物的设计引物本身尽量不要有二级结构（上下游之间，发夹结构）GC数量之和与AT数量之和相差不大，并且均匀分布产物片段不要太大，一般100-200bp左右为宜加样前的准备工作将DNA样品或cDNA样品做适当稀释标明加样板上每个孔中要加的模板及引物，相同的样品尽量排列在一起，以免污染或错加写明反应体系写出清晰明了的分装示意介绍CNV尤斯灌流室系统（Ussing

Chamber）尤斯灌流室系统1951年,丹麦学者Hans

Ussing首次将Ussingchamber(尤斯灌流室)介绍于世,其主要功能是通过微电极检测整个细胞膜离子通道变化的电流信号,来反映肠道药物吸收、通透性和分泌情况的变化。上皮细胞电生理基础。上皮组织构成：密集排列的上皮细胞;细胞间质上皮组织特征:极性:细胞顶面和基底面结构和功能分布不均形成紧密连接:阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内。紧密连接的形状和渗透性决定上皮组织的完整性以及对物质的阻抗力(Rt)。一般都能进行钳电压和钳电流操作。尤斯灌流室系统原理尤斯灌流室系统组成单个独立的尤斯灌流室（Ussing

chamber）；用于控制温度的加热块；用于调节氧化与气升搅拌气流的针形阀；用于测量跨上皮电压和通过电流的Ag/AgCl参考电极；与电压/电流钳的连接导线。打开水浴预热、尤斯灌流装置及计算机；插入电极、连接电极线、调零；开气阀，系统条件稳定以后装入组织；

打开‘Acquire

and

Analyze

2.3’软件，开始记录电流及电阻。尤斯灌流室系统操作步骤目前,

其应用主要集中在药学领域,通过微电极检测细胞膜离子通道的电流及电阻变化：测定转运电流：是否有载体或外流泵参与转运；肠道的通透性研究；研究药物的肠代谢、肠腔的分泌情况；研究药物对肠电生理参数的影响等。尤斯灌流室系统应用介绍CNV膜片钳制技术（Patch-clamping）德国科学家Erwin

Neher和Bert

Sakmann(1991年诺贝尔医学生理学奖)发明的可以记录单一离子通道电流的电生理学技术。在单细胞膜片钳记录系统中，完整的记录系统主要包括以下配置：

电子原件（膜片钳放大器、数模/模数转换器）、微操作器、实验平台（防震台、屏避罩、空气泵）、显微系统、给药系统、微电极拉制器、微电极抛光仪等。膜片钳实验系统的基本配置Axopatch

200B膜片钳放大器

专门用于细胞膜电位信号放大的单探头超低噪声膜片钳放大器。

主要应用于单通道记录、全细胞记录、人工双分子层膜片钳记录、松散封接记录、电化学检测（伏安法/安培测量法）。最适合进行单通道记录，尤其是小电导的单通道记录。其主要特点为具有超低噪声，是目前世界上噪声最低的膜片钳放大器之一。膜片钳系统的操作步骤１．膜片钳微电极制作(1)

玻璃毛细管的选择：直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在

1.1-1.2mm，内径1mm。软质的苏打玻璃硬质的硼硅酸盐玻璃(2)电极的拉制