DB2308T 182-2023 稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范

ICS65.020.20B05

DB23黑龙江省佳木斯市地方标准DB2308/T182—2023稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范2023-12-11发布 2024-01-11实施佳木斯市市场监督管理局 发 布DB2308/T182—2023DB2308/T182—2023前 言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所。本文件主要起草人：陆文静、周通、王桂玲、周雪松、韩笑。2023年首次发布。I稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范范围（MagnaporthePCRAVR-PiiAVR-PikAVR-PitaAVR-Piz-t、AVR-Pia、AVR-Co39PCR检测。规范性引用文件GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2 转基因产品检测实验室技术要求术语和缩略语下列术语和缩略语适用于本标准。正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称F引物。反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称R引物。DNA：Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。PCR：PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应1DB2308/T182—2023Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。DNAMarker：标准分子量的核酸标记。原理提取稻瘟病菌菌丝DNA，根据无毒基因保守区域序列设计特异性引物，对样品进行PCR扩增，根据序列比对结果，依据是否扩增得到预期的DNA片段大小的序列来判断样品是否携带该无毒基因。仪器设备（NanoDrop2000）、基因扩增仪、琼脂糖电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统，其它相关仪器设备。试剂及样品0.05g～0.1g10%CTAB5MNaCl0.5MEDTA（pH1MTris（pH8.0）、1×TE缓冲液、氯仿：异戊醇（24：1）、75乙醇、Goldenview等。除非另有说明，仅使用分析纯试剂和ddH2O或符合GB/T6682规定的一级水。实验过程防污染措施检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。实验步骤稻瘟病菌菌丝DNA提取0.1g2mL65DNA70065115minDNADNA的提取效率12000r/min10min600μL2mL（24﹕1）5min～10r/min10min500μL1.5mL5min～10min，12000r/min10min300μL于新的1.5mL900μL、-20-2010min，12000r/min10min。2DB2308/T182—202375%3100μL1TENanoDrop2000测定提取DNA1×TE100ng/μL，-20PCR反应DNAPrimeSTARdNTPMixtureddH2O置于冰上融化，引物序列参考附录A。在0.2mL加盖无菌离心管中，按先后顺序加入以下试剂：PrimeSTARBuffer （5×）6μLdNTPMixture（2.5mM）2.4μL正向引物及反向引物（100nM）0.2μL（终浓度：0.2μM～0.3μM）样本DNA1μL（20-100ng）ddH2O20.1μLPrimeSTARHSDNAPolymerase（2.5U/μL）0.3μL混合后用移液枪抽打混匀，封盖后短暂离心待用。将离心管置于PCR仪中，反应程序为：955min，9530s，55℃～61℃退3030s～60A℃总延伸5min，4℃保存。电泳200mL0.50.5TBE50mL502.5μL20min0.5TBE缓冲液的5μLPCR1300.5h～1.0hPCR产物测序使用试剂盒纯化25μLPCR产物，提交至生物技术公司测序。3DB2308/T182—20239 结果分析PCRPCR附 录 A（规范性附录）用于扩增无毒基因的引物引物无毒基因引物序列 （5′-3′）延伸时间（s）退火温度（℃）Primer1Avr1-Co39FCTCTGAACAACTAAGCAACA4055RCAACCTGGACTCTTATTGATCPrimer2Avr-PiaFTTATTGCTACCACCTTCCTC3055RGTAGTAACTGAGTTGGCGTTPrimer3Avr-PiiFCCTCGGCTTCTTGTATATTACT3055RTAAATCGTGCGCTTTCAGATPrimer4Avr-PikFCTGCACACATCAACAGTCTT3056RTCACAGTTAAGGCAACGTAGPrimer5Avr-Pita1*FGTTTCCGCCTTTATTGGTTT5056RAATCCCATCCCATTCGTAACPrimer6Av