基于倒易空间位相的溶菌酶结构相位化的纯直接法

基于倒易空间位相的溶菌酶结构相位化的纯直接法

在x射线衍射实验中，我们测得的是与衍射强度无关的位相，但计算电子密度图的强度和位相是测量结构的中心问题。过去，大结构的位相通常采用多对同晶或多分子变换法，但它们需要特定的原子存在或一些已知结构骨架的信息，这给样品的制备带来了许多困难和限制。20世纪60年代，范海福首次用直接方法研究了单通道同晶或单波长反演的破联问题。在过去的十年里，它取得了突破。该项目包含一个cu和1300个非h按钮的原子。该项目已被纳入ccp4包，并已成为破双解的有力工具。作为abinitio的纯直接法与上述方法不同,它只需要蛋白质结构的母体数据,用归一化结构振幅直接求解位相.1993年Weeks,Miller和Hauptman等人研究成功的双空间法SnB,它是在倒易空间修正位相,在正空间的密度图上筛选原子,交替叠代直至收敛.Sheldrick和Gould采用相同策略不同做法研究成了SHELX-D.这二个程序都解出了传统直接法不能解的三斜晶系的溶菌酶结构,它含1001个不重于S的非H肽原子.这是目前文献报道的用纯直接法解出的最大结构.还有一种纯直接法是由Karle-Hauptman行列式发展来的,已由Graaff及其合作者设计完成了程序CRUNCH.目前已能测定接近小蛋白质水平的大分子结构.我们把系统论和优化法的策略应用于直接法,研究成功了系统优化法及其程序SYSTEM-99.通过一种有效的目标函数,在倒易空间直接求解位相.现已用0.110nm分辨率的母体数据解出了含1914个不重于S的非H肽原子天花粉蛋白可供精修的模型,它比溶菌酶的结构大了近一倍.目前纯直接法的限制是必须要有原子分辨率(优于0.12nm)数据.然而由于蛋白质结构大且含H2O多的特点,很难得到高分辨的数据.所以用通常分辨率的母体数据求解位相是向纯直接法的挑战.1归一化结构因子e的振幅把系统论和优化法的思想用于以结构不变量概率分布为基础的纯直接法,我们研究成功了一种新的测定晶体结构的系统优化法.它不仅适用于中小分子结构,更适用于只用母体数据对小蛋白质和其它同类大小的结构的位相直接求解.该方法有以下三个特点:(1)把用于结构测定的反射根据结构大小和反射间相关的强弱即α(h)期望值<α(h)>的高低,沿逆收敛图方向划分成一个个子系统,使系统位相的求解有充分的信息基础.根据定义式中N为单胞内等重原子的数目;丨E丨为归一化结构因子E的振幅;h和k为反射的指标向量.从式(1)可以看到,随系统内反射数增加,增大更快,可以补尝因N的增大而引起的α(h)的减小.从结构不变量概率分布理论知道,由多个相关的已知位相推导一个未知位相Φ(h),α(h)越大,测定位相的概率误差越小.(2)优化的目标函数是一种新的极小化函数,称为SIF.其形式如下:式中从上面式子看出,K(h,k),<α(h)>和W(h)都是由归一化结构振幅丨E丨计算得到的模结构不变量,而Φ(k)+Φ(h-k)-Φ(h)是一个三位相结构不变量.故目标函数只与结构有关.它有两点与众不同:(a)虚部和实部的双重约束,强化了位相间的整体制约关系.(b)<α(h)>越大,Φ(h)的误差越小,W(h)在目标函数中占的比例也大.后者起整体约束的作用.SIF的上述品质使它成为更有效的极小化函数,并且作为系统优化法评价整体位相质量的标准(Sifom).(3)求解位相按系统进行.先给待测位相赋随机值,再以从大到小的不定增量的移动,通过目标函数减小对系统内的随机位相进行规划,最终使它们达到目标函数极小,成为整体有序的结构的正确位相.实验证实,tangent公式无力对它们进行整体修正.以上叙述说明,应用于大分子结构位相求解的系统优化法是一种纯直接法,它只需要知道单胞内原子的种类和数目以及母体的衍射数据,即可在倒易空间内应用归一化结构振幅,直接求解位相.这种方法的程序称作SYSTEM-99,按设计它可对近万个反射的位相直接求解.2分子结构模型该程序研究成功以来,已对三个小蛋白质结构的母体数据直接求解位相.从E图得到分子片断的初始模型,再对全部衍射数据通过SIM加权叠代进行模型扩充,分别得到了三个结构可供精修的模型,最后用图形显示程序RasMol显示测定结果,并与PDB数据库中的标准数据模型比较.(1)RNAP1是一个含808个不重于S的非H肽原子的小蛋白质.SYSTEM-99程序利用0.117nm分辨率的母体数据直接解出了3105个大丨E丨值反射的位相,得到382个峰的分子片断,扩充至收敛,得到848个峰的骨架.按峰高取808个峰作为供修正的模型,如图1a所示.图1b是PDB数据库中的经过各向同性温度因子修正后的结构模型.两者形状大小相似.(2)TCS(天花粉),是一个含1914个不重于S的非H肽原子的蛋白质,利用0.110nm分辨率(高角度完整性不好)的母体数据,SYSTEM-99程序直接解出了具有大丨E丨值的3600个反射的位相,得到461个原子的分子片断,通过扩允,得到1842个峰的可供精修的模型,如图2a所示.图2h是根据PDB数据库得到的标准模型,两个模型的轮廓和大小基本相似.(3)Hg·(GRX)2的晶体结构属P212121空间群,GRX本身是一个含629个不重于S的非H肽原子的小蛋白.在晶体结构的不对称单位内有1258个非H肽原子和一个Hg原子.显而易见,这是一个有膺对称性的难解结构.母体数据的分辨率为0.101nm,用SYSTEM-99程序对具有大丨E丨值的5036个反射的位相直接求解,从直接法的品质因子明显看到,解出的位相存在膺对称性引起的对映体混杂,根据过去经验我们采用连续投Hg加一个最大骨架通过SIM加权叠代,分离对映体同时发展模型.所以开始投E图中最大骨架(Hg+149个C)叠代扩充至收敛,得到1100个峰的分子片断,其中最大骨架855个峰,再改投Hg加密度图上所有分子片断的峰扩充模型至收敛,最终得到1338个峰的分子骨架片断,其中最大骨架有1139个峰,按峰高截取1259个,1号峰为Hg,作为供精修的模型,如图3所示.从图看出与Hg相连的二个GRX蛋白分子轮廓界线.这是个未知结构,没有参比物.3系统-29程序调整并进行ccp4速度研究上面的实验,显示了系统优化法作为一个abinitio方法只用小于0.12nm高分辨母体数据直接从归一化结构振幅丨E丨求解生物大分子结构位相的超常能力,今后能求多大的结构还不知道.纯直接法发展方向是与WARP和CCP4两个程序结合,只要有一部分大致正确的位相或相应水平的原子模型,不论高分辨数据或通常分辨率的数据都可用WARP进行模型的修正和扩充,再用CCP4程序完成结构的测定.直接对通常分辨率的蛋白质母体数据求解位相,这是对纯直接法的挑战.最近我们分别对RNAP1和天花粉的母体数据截成0.200nm分辨率的数据套,用SYSTEM-99程序直接求解位相,得到了符合直接法评价标准(RNAP1:absfom=1.318,Ψ0=1.080,R=·403,Sifom=·496;TCS:absfom=1.193,Ψ0=·848,R=·364,Sifom=·449)的可喜结果.目前正安装调试WARP和CCP4,准备对包括通常分辨率在内的