蛹虫草培养基的优化研究

蛹虫草培养基的优化研究

蛹草科又称北虫，属于囊性菌科、肉科、麦角形菌科和甘草科。它是一种稀有的药物和食品菌。它具有抗疲劳、抑制肿瘤和提高身体活力的作用。市场需求量与日俱增，具有很大的研究和开发空间。天然虫草资源十分匮乏,而半人工栽培生产周期长,且技术不易掌握。通过液体深层培养法可获得与天然虫草化学成分相近的菌丝体,还可获得次生代谢产物,且能大大缩短生产周期。所以,液体发酵培养虫草菌丝是获得虫草产品的重要手段。大多学者研究了蛹虫草固体培养基的栽培技术,而忽略了液体发酵深层培养的重要性及优势。为此,本研究对蛹虫草菌丝液体发酵条件进行了系统研究,以明确不同碳源和氮源对蛹虫草菌丝生长的影响,筛选出符合要求的碳源和氮源,从而筛选出优质液体培养基配方,旨为蛹虫草生产及相关科学研究提供技术参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒蛹虫草斜面固体菌种,由辽东学院实验中心微生物实验室提供。1.1.2试剂1.1.2.1碳源葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉。均为AR试剂,国药集团化学试剂有限公司生产。1.1.2.2.氮的来源蛋白胨、牛肉膏和酵母浸膏,均为BR试剂,天津大茂化学试剂厂生产;柠檬酸氢二铵,为AR试剂,国药集团化学试剂有限公司生产。1.1.3仪器和设备LDZX-F50立式电热高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂),超净工作台(北京亚泰科隆实验科技开发中心),Hps-160bs-Ⅱ恒温恒湿培养箱(北京泰亚赛福科技发展有限责任公司),SHA-C型水浴振荡器(金坛市高尔实验仪器厂),离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司),远红外快速恒温干燥箱(吴江华东标准烘箱有限公司),SHZ-ⅢA循环水式真空泵(河南一恒仪器有限公司)。1.1.4培养基1.1.4.1种子的扁平梯度马铃薯200g,葡萄糖20g,蛋白胨5g,磷酸二氢钾2g,琼脂20g,水1000mL,pH值自然。1.1.4.2.基础液体发酵培养基葡萄糖20g,蛋白胨5g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁1g,盐酸硫胺素15mg,水1000mL,pH值自然。1.2培养子平板培养基先进行菌种活化。将斜面固体菌种接种在种子平板培养基上,在恒温培养箱内20～22℃条件下培养7d,菌丝长满后转色,备用。本研究分适宜碳源和氮源2个部分进行。1.2.1关于碳源的研究1.2.1.培养基的碳源制备试验设葡萄糖(CK)、乳糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉5种碳源处理,分别以20g/L浓度替代液体发酵基础培养基中的唯一碳源(葡萄糖)制备培养基。液体培养基分装在250mL三角瓶内,每瓶100mL,5次重复。所有培养基均常规灭菌。在无菌条件下,用打孔器取活化菌种接到液体培养基内,于20～22℃、130r/min条件下振荡培养。7d后将发酵液过滤,菌丝用蒸馏水冲洗干净,于60℃条件下烘干后称重。比较菌丝干重,筛选出最佳碳源种类。1.2.1.培养基的制备以1.2.1.1筛选出的最佳碳源种类为碳源,分别以10、15、20、25和30g/L浓度制备培养基。利用与1.2.1.1相同的方法接种、培养、过滤、烘干和称重。比较菌丝干重,确定最佳碳源适宜的浓度。1.2.2关于氮源的研究1.2.2.培养基的制备试验设蛋白胨(CK)、牛肉膏、酵母浸膏和柠檬酸氢二铵4种氮源处理,分别以5g/L浓度替代液体发酵基础培养基中的唯一氮源(蛋白胨)制备培养基。利用与1.2.1.1相同的方法接种、培养、过滤、烘干和称重。比较菌丝干重,筛选出最佳氮源种类。1.2.2.培养基的制备以1.2.2.1筛选出的最佳氮源种类为氮源,分别以10、15、20、25和30g/L浓度制备培养基。利用与1.2.1.1相同的方法接种、培养、过滤、烘干和称重。比较菌丝干重,确定最佳氮源适宜的浓度。2结果与分析2.1蔗糖培养产量5种碳源培养基中,可溶性淀粉培养的菌丝产量(菌丝干重2.091g/L)最高,且显著高于其他处理;蔗糖培养产量(菌丝干重1.891g/L)次之;麦芽糖培养的菌丝产量最低(菌丝干重1.324g/L),但与乳糖培养的菌丝产量(菌丝干重1.366g/L)差异不显著(表1)。因此,确定液体发酵培养基的最佳碳源为可溶性淀粉。2.2可溶性淀粉用量对枯草芽孢杆菌生长的影响菌丝产量随可溶性淀粉浓度的升高而增大,浓度为20g/L时,菌丝产量最高为2.135g/L;当可溶性淀粉浓度增加到25g/L时,菌丝产量增加不明显;当可溶性淀粉浓度再增加时,菌丝生长呈停滞趋势(表2)。因此,确定液体发酵培养基中可溶性淀粉的最佳浓度为20g/L。2.3其他处理前后织物上添加3.5%的时率4种氮源培养基中,酵母浸膏培养的菌丝产量(菌丝干重2.231g/L)最高,显著高于其他处理;牛肉膏培养的菌丝产量<CK,但差异不显著;而柠檬酸氢二铵培养的菌丝产量显著<CK(表3)。因此,确定液体发酵培养基的最佳氮源为酵母浸膏。2.4不同浓度5g/l时枯草芽孢芽孢杆菌干重5g/l在试验浓度范围内,菌丝产量随酵母浸膏浓度的升高而增大,在浓度为5g/L时菌丝产量出现高峰值(菌丝干重2.390g/L),其后产量稍有下降但并不明显(表4)。因此,确定液体发酵培养基中酵母浸膏的最佳浓度为5g/L。3酵母粉用量对各培养菌株的影响本研究结果表明,在蛹虫草菌丝液体发酵培养基中,碳源以可溶性淀粉最为适宜,适宜浓度为20