阿托品对去甲肾上腺素大鼠模型的扩血管作用

阿托品对去甲肾上腺素大鼠模型的扩血管作用

临床上可用于治疗性休克，扩张微血管，缓解痉挛，改善微循环，缓解休克症状。其机制不能基于阻止m受体来解释。对于阿托品的扩血管作用机理,有以下几种推测:是机体对阿托品引起的体温升高的代偿性散热反应;与α肾上腺素受体有关;与内皮细胞有关。尽管有报道阿托品扩张NE预收缩家兔胸主动脉条和苯肾上腺素(PHE)预收缩家兔海绵体的作用不依赖于内皮功能,但也有研究表明阿托品扩张PHE预收缩大鼠胸主动脉、肾动脉以及肠系膜动脉为内皮依赖性。本文旨在对阿托品扩血管作用机理进行研究。阿托品的糖代谢动力学wag动物Sprague-Dawly(SD)大鼠,体重180-220g,♀♂兼用,由西安交通大学实验动物中心提供。合格证:陕动证字08-005号。药品及试剂阿托品和去甲肾上腺素(noradre￣naline,NE):天津金耀氨基酸有限公司产品;乙酰胆碱(acetylcholine,Ach):上海雪满生物科技有限公司产品;L-Nω-硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-argininemethylester,L-NAME),TritonX-100,格列本脲片(glibenclamide,Glib)及吲哚美辛(indomethacin,Indo)均为Sigma公司产品;咖啡因(caffeine),熔点标准品,陕西省药品检验所馈赠。主要仪器PowerLab数据记录和分析系统,包括软件Chart5.0以及硬件8通道桥式放大器(ADInstrumentsCo.,Australia);FT03C张力换能器(GrassInstrumentCo.Quincy,Mass.,USA);Myograph恒温浴漕(DMT,Denmark)。离体血管实验大鼠断头处死,迅速取出肠系膜上动脉,浸入冷Krebs液中,显微镜下剥离血管周围组织。去内皮组在实验前用0.1%TritonX-100灌注血管5s,然后用Krebs液灌注10s。将处理好的血管切成1mm长的圆筒段,将其套在两个L型的金属针上,其中一个连接FT03C张力换能器,另一个连微调装置(调节负荷张力)。将安装好的动脉环置入含有Krebs液2.5mL的37℃恒温浴槽,持续通入含95%O2和5%CO2的混合气体,pH保持7.4。实验前,动脉环静息负荷2mN,每20min换液1次,稳定1.5h。以K+-Krebs液(含60mmol·L-1K+)检验动脉环收缩性,两次收缩幅度相差小于10%者用于实验。以Ach(1×10-5mol·L-1)检验内皮功能,舒张率小于10%的认为内皮完全去除,大于75%的认为内皮完整。一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME(1×10-4mol·L-1),环氧酶抑制剂Indo(1×10-5mol·L-1),β受体阻断剂普萘洛尔片(Prop,5×10-6mol·L-1)以及KATP通道抑制剂Glib(1×10-5mol·L-1)均预孵育30min,后以NE(1×10-5mol·L-1)预收缩血管,收缩稳定后累加浓度法加入阿托品,绘制阿托品舒张的量效曲线。统计学分析以动脉环最大收缩幅度为100%,计算阿托品的舒张率。结果以x¯±sx¯±s表示并进行方差分析及t检验,以P<0.05为显著性指标。结果1阿托品对全国范围内最大张力血管的扩张作用以1×10-5mol·L-1NE预收缩血管,稳定后浓度累加法加入阿托品。从图1结果可见,阿托品能浓度依赖性地舒张NE预收缩完整内皮的血管,其最大舒张率(Rmax)为(90±6)%(n=8),pEC50为5.51±0.25。阿托品亦能浓度依赖性地舒张NE预收缩的去除内皮的血管,但其舒张作用明显减弱,Rmax为(67±8)%,与完整内皮的血管比较P<0.01;对去除内皮血管阿托品舒张的pEC50为5.24±0.14,与内皮完整组相比P<0.05。2阿托品作用下kcl量效关系去内皮血管,稳定1.5h,浓度累计法加入KCl(10,20,40和80mmol·L-1),得量效曲线。后冲洗标本至基线,加入阿托品(1×10-4.5mol·L-1)作用10min,同法加入KCl获得阿托品作用下的KCl量效曲线。结果发现阿托品对KCl量效曲线无明显影响(图2)。3阿托品对无钙krebs液中ni和cacl2缩血管效应的抑制效果去内皮血管,平衡1.5h后,用K+(60mmol·L-1)和Ach(1×10-5mol·L-1)分别检验血管活性和内皮功能,合格后,换用无钙Krebs液(正常Krebs液中无CaCl2并加入Ca2+络合剂1×10-4mol·L-1EGTA),孵育5min,然后加1×10-5mol·L-1NE,可见动脉环产生迅速而短暂的收缩,平稳后加入1mmol·L-1CaCl2,可见动脉条再次收缩并达峰值,作为药前对照。然后用Krebs液反复冲洗5次,平衡45min,加入无钙Krebs液的同时分别加入不同浓度阿托品(1×10-5.5,1×10-5和1×10-4.5mol·L-1)作用5min,重复上述实验。实验结束前再做1次无钙NE收缩对照,收缩高度与用药前对照基本一致。计算阿托品对无钙Krebs液中NE或CaCl2缩血管效应的抑制率。阿托品1×10-5.5,1×10-5和1×10-4.5mol·L-13个浓度对NE诱导收缩的抑制率分别为(36±17)%,(57±22)%和(75±11)%;阿托品3个浓度对CaCl2诱导收缩的抑制率分别为(19±13)%,(40±21)%和(64±19)%。经检验,阿托品舒张血管的作用有明显的浓度依赖关系(表1),说明阿托品能浓度依赖性地明显抑制NE诱导的内钙释放以及经受体操纵性钙通道(receptoroperatedcalciumchannel,ROCC)的外钙内流,提示阿托品的扩血管作用与ROCC以及内钙释放有关。n=8,x¯±s.∗P<0.05,**P<0.01vsn=8,x¯±s.*Ρ<0.05,**Ρ<0.01vscontrol;△P<0.05vsatropine(1×10-5mol·L-1)group4阿托品的抑菌活性完整内皮动脉,分别以L-NAME(1×10-4mol·L-1)和Indo(1×10-5mol·L-1)预孵育30min阻断一氧化氮(nitricoxide,NO)和前列环素(prostaglandinI2,PGI2)途径,观察阿托品的舒张效应。结果发现,L-NAME和Indo对阿托品的扩血管作用无明显影响(抑制率分别为6.0%和-5.7%)。5阿托品的拉伸试验去除内皮血管,Prop(5×10-6mol·L-1)和Glib(1×10-5mol·L-1)预孵育30min,NE预收缩大鼠肠系膜动脉,稳定后按浓度梯度法加入阿托品,观察阿托品的舒张效应。结果表明,β受体阻断剂Prop和KATP通道阻断剂Glib对阿托品扩血管作用均无显著性影响(抑制率分别为3.9%和0.2%)。6阿托品对krebs-l-1的抑制率去除内皮血管,于无钙Krebs液中加入30mmol·L-1咖啡因,可见动脉环产生迅速而短暂的收缩,作为药前对照。然后用正常Krebs液反复冲洗并平衡45min。再在无钙Krebs液中加入1×10-4.5mol·L-1阿托品后,重复上述实验。实验发现,阿托品组与对照组的抑制率分别为(14±10)%和(14±18)%,两者差异无显著性。表明在无钙液中阿托品对咖啡因诱导的血管收缩无明显影响。阿托品在扩血管效应中的作用NE不仅可促进细胞内钙释放,也可诱导细胞外钙经ROCC内流而收缩血管。实验发现阿托品能舒张NE预收缩的血管,且内皮去除后该作用降低,说明阿托品舒张作用有一定的内皮依赖性。目前发现内皮依赖性舒张反应是由NO,PGI2及EDHF共同作用完成的,本实验发现NOS抑制剂L-NAME和环氧酶抑制剂Indo对阿托品的扩血管作用无明显影响,表明阿托品源于内皮的扩血管作用与NO和PGI2途径无关,可能与EDHF有关,这正与临床上阿托品用于感染性休克(改善微循环)一致。因为存在着一种EDHF在微小阻力血管中介导血管舒张的代偿机制,Ach介导的微血管舒张主要靠EDHF的调节,其作用较NO强。因此阿托品被用于改善微循环障碍可能部分是由于其促进了内皮细胞层释放EDHF,从而起到扩张阻力血管的作用。在考察血管平滑肌在阿托品扩血管效应中的作用时发现,β受体阻断剂Prop和KATP通道阻断剂Glib对阿托品的扩血管作用均无显著性影响,提示阿托品的扩血管作用与β受体及KATP通道无关。离体血管在含钙营养液中,高钾诱导细胞膜电位去极化,激活电压依赖性钙通道(voltagedependentcalciumchannel,VDCC),引起胞外钙内流而诱发血管收缩。实验中发现阿托品对KCl量效曲线无明显影响,说明其不能抑制外钙经VDCC内流。在无钙液中NE和咖啡因引起的快速而短暂的收缩认为是细胞内Ca2+释放所致,将CaCl2加入浴槽中引起的继续收缩认为是细胞外Ca2+内流的结果。细胞内Ca2+的释放有IP3受体和Ryanodine受体-Ca2+释放途径。咖啡因作为研究Ryanodine受体-Ca2+释放途径的一种工具药,主要通过后者起作用。实验发现,阿托品能浓度依赖性地抑制NE诱导的内钙释放以及经ROCC的外钙内流,提示阿托品的扩血管作用与ROCC以及内钙释放有关;但阿托品对咖啡因引起的血管收缩无明显影响,提示阿托品可能主要通过抑制IP3受体中介的钙释放起作用,对Ryanodine受体途径无明显影响。与以往多采用胸、腹及肺主动脉等弹性贮器血管来研究阿托品的扩血管作用不同