高效液相色谱法测定左氧氟沙星血药浓度

高效液相色谱法测定左氧氟沙星血药浓度

左氧氟沙星（lvll）是氧氟沙星的光学活性异构体，其抗菌活性约为氧氟沙星的两倍。临床用于治疗敏感菌引起的中、重度呼吸系统、泌尿系统、消化系统和皮肤软组织感染等。为开展LVFX临床药物动力学及LVFX与其他药物之间的药物动力学相互作用研究,我们建立了测定LVFX血药浓度的高效液相色谱法。1材料和方法1.1u3000交流波长紫外检测仪器Waters高效液相色谱仪,包括M510型泵,486型可变波长紫外检测器,U6K进样器,746型数据处理机(美国Waters公司)。色谱柱为YWG-G18柱(大连依利特公司)。1.2苯精、盐酸左氧氟沙星胶囊盐酸左氧氟沙星对照品(丹东锦江药厂,批号000216),替硝唑精制品(湖北广济药业有限公司,批号970609),盐酸左氧氟沙星胶囊(本院制剂室,批号990713)。甲醇、乙腈为色谱纯,水为亚沸蒸馏水,溴化四丁基铵、乙酸乙酯、无水乙醇等试剂为分析纯。1.3标准溶液的配制精密称取左氧氟沙星对照品、替硝唑精制品适量,分别用甲醇和无水乙醇溶解后定容,配成浓度为1mg·ml-1的标准储备液。左氧氟沙星置冰箱4℃,替硝唑置室温避光处保存。临用前用甲醇稀释至所需浓度。1.4醇-乙腈-1.1mol-1磷酸二氢钾-1.5和磷酸化四丁基铵5.5%的优化色谱柱:YWG-C18柱,10μm,200mm×5mm;流动相:甲醇-乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氢钾-0.5mol·L-1溴化四丁基铵(10∶10∶80∶4),磷酸调pH3.5;流速:1.0ml/min,柱温:室温,紫外检测波长:294nm,进样量:20μl。1.5水相溶解-水相溶解gc/l取血清0.5ml,置10ml具塞试管中,加内标液(0.1mg·ml-1替硝唑液)5μl,加乙酸乙酯4.5ml,涡旋5min,3000r/min离心10min,取上清液4.0ml,50℃水浴下氮气吹干,残渣用100μl流动相溶解后进样。2结果2.1内源性杂质不干扰测定在上述色谱条件下,LVFX与内标得到较好的分离,保留时间分别为5.8min和9.5min,血清中内源性杂质不干扰测定,理论塔板数按LVFX峰计算为1160。色谱图见图1。2.2血样、回血处理取空白血清,加入不同量的LVFX对照品溶液,使浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0mg·L-1,按照“1.5血样处理”项下操作,每个浓度平行做7份。经色谱分离,计算LVFX峰面积与内标峰面积之比(As/Ai),以As/Ai为横坐标,LVFX浓度C(mg·L-1)为纵坐标进行回归,得血清中LVFX标准曲线。回归方程为:C=0.5977As/Ai-0.0053,r=0.99996当S/N≥3时,最小检测浓度为0.025mg·L-1。2.3加样回收率测定制备LVFX浓度分别为0.2、0.5和2.0mg·L-1的血清样品各5份,按照“1.5血样处理”项下操作,进样测定,计算回收率。3种浓度的平均回收率为99.33%,RSD为4.68%,见表1。2.4日内rsd测定在空白血清中分别加入不同量的LVFX对照品溶液,制备成LVFX血清浓度分别为0.2、0.5、2.0mg·L-1的样品,按照“1.5血样处理”项下操作,1d内重复测定5次,测得日内RSD分别为4.21%,1.77%和4.05%。另取上述不同浓度的血清样品,同法处理,重复测定5d,测得日间RSD分别为4.86%,5.47%和2.87%。2.5血药浓度检测健康杂种犬3只,♂♀兼有,体重13～16kg,poLVFX胶囊100mg,于给药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0,12.0、24.0h分别取静脉血1ml,分离血清,按照“1.5血样处理”项下操作,测定血药浓度。用3P87实用药代动力学程序对健康犬poLVFX后的血药浓度-时间数据进行曲线拟合,模型判断符合一级吸收二室模型,药物动力学参数见表2。3冲液与有机溶剂的比例和ph值的影响文献报道用高效液相色谱法测定LVFX血药浓度时,流动相多采用磷酸-乙腈或甲醇-磷酸盐缓冲液,并分别加入三乙铵或溴化四丁基铵改性。本实验中发现在甲醇-磷酸二氢钾缓冲液-溴化四丁基铵溶剂系统中加入乙腈可使峰形及分离度得到改善。缓冲液与有机溶剂的比例和pH值对保留时间和分离度有影响,随着缓冲液比例增加或pH值增高,保留时间延长。经实验我们选择缓冲液比例为80%,pH3.5,使LVFX峰与内标峰的分离度及保留时间均符合要求。在选择血清样品处理方法时,曾试用高氯酸、三氯乙酸、乙腈等沉淀蛋白,离心后取上清液直接进样,用二氯甲烷-异丙醇混合溶剂、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂萃取,氮气吹干,流动相重组后进样等方法。实验结果表明,用乙酸乙酯萃取的方法干扰成分少且样品及内标萃取效率高。本文所建立的方