脑缺血缺氧后钙稳态失衡分子机制及防治进展

脑缺血缺氧后钙稳态失衡分子机制及防治进展

缺血性脑损伤的病理生理机制非常复杂，不同的内源性氨基酸、自由基、钙超标和相关死亡基因的发现和炎症反应起到了重要作用。缺血后的神经元死亡包括坏死和凋亡两种方式,缺血核心区以坏死为主,而半暗带内的迟发性神经元死亡则以凋亡为主。钙超载是凋亡过程中的关键因素,也是各种有害因素致神经元死亡的最后共同通路。钙超载可以通过激活氧化应激反应产生氧自由基、引起线粒体损伤以及激活蛋白激酶等三种途径引起神经元死亡。本文拟对缺血性脑卒中钙稳态失衡分子机制和有关防治进展作一综述。一、特殊系统ca2+正常神经元内Ca2+含量与细胞液相近,细胞浆内的静息游离钙离子浓度([Ca2+]i)仅在0.1μmol/L左右,细胞内Ca2+库可以吸收和释放Ca2+,如内质网类Ca2+库和线粒体。神经元主要通过配体门控钙通道、电压依赖性钙通道、胞内细胞器上钙通道、Ca2+-ATP酶和钙受体蛋白等维持正常的Ca2+梯度。在中枢神经系统内Ca2+参与神经元兴奋性调节、神经递质合成与释放、神经元营养和发育等多项功能活动。缺血引起的胞浆[Ca2+]i的增加来自于细胞外Ca2+内流,细胞内储存Ca2+释放以及胞浆Ca2+的外排能力下降。当钙内流过多或胞内储存钙释放过多,超出神经元对Ca2+的调节能力时,引起钙超载。(一)三-三已药物作用谷氨酸-钙超载-兴奋性毒性理论认为脑缺血缺氧后能量代谢障碍,引起细胞膜Na+-K+ATP酶活性下降,胞外K+浓度显著升高,神经元去极化,谷氨酸大量释放;由于Na+/K+跨膜梯度破坏和神经元去极化,抑制细胞对谷氨酸的摄取,使细胞间隙谷氨酸大量积聚,激活细胞膜上的N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体,使受体操纵的钙通道病理性开放,大量Ca2+进入细胞内引起钙超载,谷氨酸主要通过钙超载介导细胞损伤。但是在损伤前或后短时间内立即施加一、二、三代谷氨酸受体拮抗剂的临床试验,结果未显示神经保护作用。谷氨酸还可激活代谢型红藻氨酸/α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(AMPA)受体,促进Na+内流和K+、Cl-外流,细胞膜持续去极化,启动电压依赖性钙通道开放,加重钙超载。动物试验证明AMPA受体拮抗剂如ZK200775的有效性,并通过健康志愿者的耐受性试验,但是随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床研究,发现ZK200775具有明显的镇静作用,连续使用引起短暂性神经系统功能恶化,甚至木僵和昏迷,因而提前终止试验。NMDA受体是对Ca2+高度通透的配体门控离子通道,受谷氨酸竞争性激动剂控制,还受多种内源性物质和药物的影响,如甘氨酸变构调节位点。在低浓度甘氨酸存在时,L-谷氨酸所产生的NMDA受体兴奋性提高。研究显示神经元细胞外甘氨酸的浓集与脑缺血早期神经元损伤有直接的相关性。甘氨酸主要有抑制神经递质和调节NMDA受体的兴奋性作用。作用于NMDA受体甘氨酸位点的非竞争性拮抗剂,能够有效抑制某些脑区高水平神经递质。如谷氨酸的影响,也能相对保持其他脑区神经递质的正常传递,也无其他谷氨酸受体拮抗剂有关的细胞空泡现象,但是甘氨酸位点拮抗剂如SM31900的临床研究,结果未显示明显防治神经元缺血性损伤的效果。另外,研究发现高活性甘氨酸裂解酶系(theglycinecleavagemultienzymesystem,GCS)抑制细胞外甘氨酸浓集,低分子GCS增强剂也有望成为新型神经保护药物。(二)治疗慢性脑缺血脑缺血后中心区立刻出现的神经元死亡与Ca2+超载密切相关,缺血早期Ca2+流入介导电压敏感性Ca2+通道,缺血神经元ATP耗竭使细胞膜上依赖ATP的Na+/K+泵失效,产生膜去极化,激发Ca2+通过电压敏感性Ca2+通道流人细胞内,影响钙激活性钾通道、氯通道和非特异性阳离子通道,刺激大量钙内流。许多研究涉及二氢吡啶敏感的L型钙通道,但是这些钙通道拮抗剂用于急性缺血性卒中患者的效果不明显。Hou等提出NMDA受体和L型电压依赖性钙通道共同作用,使脑缺血再灌注时神经细胞内Ca2+增多致细胞死亡。Zhu等以钙促钙机制认为脑缺血时神经细胞膜上电压敏感性钙通道开放使胞内Ca2+增加,经过信号转导激活内质网上三磷酸肌醇(IP3)促钙释放。目前研制的钙拮抗剂注重作用的多样性,可阻断神经元死亡级联反应中的多个环节,处于动物试验阶段,需进一步临床研究验证其疗效。山豆根碱(dauricine)可阻断N型电压依赖性钙通道,也可阻断钠通道和T型电压依赖性钙通道,保护神经元免受多种有害刺激,也可阻断神经元P型电压依赖性钙通道,Li等发现缺血缺氧海马脑片及大脑中动脉阻塞模型中,山豆根碱可抑制Ca2+从内质网释放和从胞外内流,通过降低胞内Ca2+浓度以降低线粒体膜通透性,防止神经元损伤。力黎芦醇(resveratrol,Res)直接作用于钙通道,抑制电压依赖性钙通道介导的钙超载,还有抗氧化作用以及下调天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)等作用,防止神经元细胞凋亡,动物试验已证实其有效。双苯氟嗪(dipfluzine,Dip)是桂利嗪类钙拮抗剂,可有效减少钙内流,抑制海马神经元凋亡以及caspase-3的表达,阻止正常神经元的丢失,提高神经元的存活率。(三)asic1是诱导心肌缺血神经元的na+、ca2+内流通道谷氨酸受体介导的钙内流仅见于缺血早期,而细胞膜上的某些蛋白质能够调控钙内流维持钙稳态。其中ASIC是上皮细胞Na+通道相关家族的成员,是由细胞外酸性环境直接激活的阳离子通道,ASIC在pH值低于7.0时开始激活,在6.0左右(缺血梗死区的pH值)半数被激活,可引起钙依赖性磷酸脂酶激活,产生钙内流。在电压依赖性钙通道和谷氨酸受体阻断剂存在的情况下,ASIC的激活能产生钙内流增加和时间依赖性神经元死亡。研究发现与多数介导钙内流的受体通道如烟碱乙酰胆碱受体和谷氨酸受体不同,受体操纵性钙通道在pH值降低时被抑制。观察ASICla亚基(对酸高敏感但失活很快)灭活的鼠,显示能够减轻诱导的脑缺血神经细胞的损害,目前认为ASIC1是介导缺血区神经元Na+、Ca2+内流的主要通道。动物脑缺血模型研究脑室内预注射ASICla阻断剂阿米洛利(amiloride)和特立尼达狼蛛毒液(tarantulatoxinpsalmotoxin)与敲除ASICla基因的实验一样,可阻止缺血的发生,并可保护神经元。(四)u3000病理组织学观察TRPM在中枢神经系统高度表达,在非选择性阳离子通道周围。TRPM7易受氧化应激激活,脑缺血缺氧时,TRPM7激活使钙通道开放,钙离子大量内流。TRPM7抑制时可减少钙内流,减少一氧化氮合酶(NOS)和活性氧(ROS)生成,防止神经元变性坏死。TRPM电位也能被酸中毒激发。研究提示TRPM7能消除抗细胞毒疗法对神经元的保护作用。匹诺卡兰(Pinokalant)是异喹啉生物碱衍生物,为非特异性阳离子通道阻断剂,部分作用于TRPM通道。研究大脑中动脉阻塞6h后,用匹诺卡兰组的局部脑血流量明显增加,磁共振成像观察梗死面积缩小60%～70%。目前尚无特异性阻断TRPM7的药物。1.5Na+/Ca2+交换剂(Na-/Ca2+exchanger,NCX)激活的TRPM7和ASIC1是介导脑缺血神经元损伤的有害因素,而NCX却是一种保护因素。NCX是神经细胞膜上介导Na+、Ca2+流动的反向转运体,维持胞浆Na+、Ca2+的稳态。正常情况下NCX作用方式是排出一个Ca2+伴随摄入三个Na+。脑缺血早期神经细胞膜Na+/K+ATP酶失活,大量钠内流致细胞内钠超载,激活NCX,将钠排出和钙摄入,以免钠超载损害神经元,但使胞浆的钙离子浓度增高。相反,脑缺血后期细胞内钙超载时,NCX又反向转运,排出钙和摄入钠,以免钙超载损害神经元。NCX有三个亚型:NCX1、NCX2和NCX3。其中NCX3在脑缺血中心区表达,是唯一能在细胞内ATP完全缺乏时也能发挥保护作用的亚型转运体。NCX下调致大量钙超载和神经元死亡。钙蛋白酶(calpain)能裂解NCX3,脑缺血后细胞内钙超载可激活calpain,再通过裂解NCX3致神经元坏死或凋亡,在缺血性脑损伤中起重要作用。钙蛋白酶抑制剂能够阻止这种裂解,防止钙超载引起的神经元死亡。Calpeptin是一种人工合成的高效、具有细胞渗透性的calpain抑制剂,对大鼠海马脑片缺氧无糖损伤具有明显的神经保护作用。Ca2+ATP酶(PMCA)在NCX3裂解后失活,促使钙离子的反向调节,支持NCX在神经元死亡中的重要作用。二、细胞内钙超载激活Annunziato指出用兴奋性毒性理论来解释脑缺血时的钙稳态紊乱过于简单,应从神经元缺血死亡的分子机制及病理生理机制等方面综合认识。(一)ATP合成减少使Na+/K+ATP酶功能降低,大量Na+内流和K+外流,细胞膜电位下降产生去极化,导致电压依赖性钙通道开放,大量Ca2+内流。(二)钙内流刺激谷氨酸释放,导致谷氨酸受体亚型的NMDA受体通道开放,大量Ca2+内流。(三)胞外Ca2+浓度的降低激活了TRPM7促使更多钙内流。(四)细胞内无氧糖酵解使乳酸堆积和细胞外酸化。(五)细胞外pH值的降低激活ASIC1,促使更多钙内流。以上因素引起细胞内钙超载使NOS、ROS生成增加,又以正反馈方式增加细胞内Ca2+浓度,并通过氧化应激进一步激活TRPM7促使钙内流。保护基因NCX具有抑制TRPM7、ASICs和NMDA受体操纵的钙通道作用,能在细胞内Ca2+浓度增高和氧化应激时被迅速激活。细胞膜上磷脂酰肌醇二磷酸(PIP3,肌醇三磷脂前体)能够同时调节NCX和TRPM的活动,保护神经元。但脑缺血时PIP3在有些脑区的量会变化,使调节NCX和TRPM的作用不明显。钙对细胞的信号传导和存活很重要,但细胞内钙超载在缺血性神经元坏死或凋亡的发生中起关键作用。紧密的离子稳态机制使钙介导的多样化信号级联放大效应,在同一个细胞内可以各自独立发生。过多的钙内流、细胞内储存钙的释放和钙外排机制受损,能使钙调节机制失效,导致细胞死亡。钙信号还能增强不依赖钙调节的死亡子程序。细胞内储存钙的重新分配放大了细胞凋亡信号,也激活钙蛋白酶执行的细胞死亡,钙超载可通过蛋白激酶C、蛋白酶SI和Ⅱ、磷脂酶A2、磷脂酶C、Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、核酸内切酶、中性蛋白酶等作用而导致神经元坏死或凋亡。Ca2+的升高参与了凋亡早期阶段的信号转导。细胞凋亡早期线粒体出现内膜通透性增加、Ca2+摄入增加、跨膜电位降低、细胞色素C和