型登革病毒在kmb17上的适应性培养及增殖动态研究

型登革病毒在kmb17上的适应性培养及增殖动态研究

病毒位于真菌病毒科，属于黄毒科黄色病毒科。它主要通过埃及蚊和白纹蚊传播，导致真菌病毒（df）、发病率高、死亡率高的登甲出血热（dhf），以及登甲休克综合征（sds）。病毒在蚊体内以及白纹伊蚊传代细胞(C6/36细胞)、猴肾、地鼠肾原代和传代细胞中能增殖,并产生明显的细胞病变。病人及隐性感染者是本病的主要传染源,而丛林中的灵长类是维护病毒在自然界循环的动物宿主。迄今为止全球仍没有获准上市的登革病毒疫苗,目前最有潜力的传统减毒活疫苗候选株是由泰国沃特瑞德研究所(WRAIR)研发的以犬肾细胞和恒河猴胚肺细胞为基质的疫苗,Vero细胞也被认为是疫苗开发的候选基质,以人源性细胞制备的登革疫苗候选株还未见报道。因此研究登革病毒在人源性细胞上的适应性对于登革病毒疫苗的研发具有重要意义。人胚肺二倍体细胞株KMB17由医学生物学研究所建立并拥有自主知识产权,作为人源性细胞基质生产人用疫苗时,引入的外源因子较少,比动物来源的细胞基质具有更好的安全性,且能实现大规模疫苗生产,已经成功应用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗的生产。本研究将Ⅲ型登革病毒中国株D9964在人胚肺二倍体细胞KMB17上培养适应,并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,成功筛选并纯化出能在KMB17细胞中稳定增殖并具有良好抗原性的适应株。此研究将打破登革病毒宿主细胞局限性,为登革病毒疫苗的研发开拓新的思路,为研发我国拥有自主知识产权的登革病毒灭活疫苗及减毒活疫苗奠定基础。材料和方法1东省疾病预防控制中心Ⅲ型登革病毒中国株D9964为广东省疾病预防控制中心惠赠,KMB17细胞(第21代)由中国医学科学院医学生物学研究所分子流行病室保存。2抗血清、igg和型登革病毒人源MEM培养基由该所生物制品四室提供;新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司;Ⅲ型登革病毒人源抗血清购自英国国家生物制品检定所(NIBSC);FITC标记的兔抗人IgG购自Sigma公司;病毒RNA/DNA抽提试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司;RealTime-PCR试剂盒购自大连宝生物公司。3方法3.1rt-pcr扩增根据卫生部发行的《登革热诊断标准》中所述的“RT-PCR技术检测登革病毒RNA及型别鉴定”方法,合成登革病毒通用引物(D1和D2)和Ⅲ型登革病毒型特异性引物(D1和TS4)。以收获10代的病毒培养物基因组RNA为模板,通过RT-PCR对Ⅲ型登革病毒特异性基因进行扩增,扩增片段大小分别为511bp和393bp。引物序列D1:5′-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3′,D2:5′-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3′TS3:5′-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3′。反应条件:50℃30min合成cDNA;94℃预变性2min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,共35个循环;最后72℃延伸7min。3.2细胞增殖检测以100μlⅢ型登革病毒中国株D9964接种长至单层、生长状态良好的C6/36细胞,37℃、5%CO2条件下培养7~10d,待细胞病变达++++,收集细胞液,于4℃,3000r/min离心5min后收获上清,-70℃保存。采用微量滴定法测定病毒滴度,将vero细胞按104个/孔接种于96孔细胞培养板,待细胞长成致密单层后,将病毒用含2%血清MEM培养基以10倍系列稀释,每个稀释度设4个复孔,每孔加入100μl,并设细胞对照和未稀释病毒对照。于37℃、5%CO2条件下培养7d,记录细胞病变程度。按Reed-Muench公式计算病毒的感染性滴度。3.3细胞培养和增殖将-70℃保存的登革病毒于37℃水浴5min,用PBS将已铺满单层,生长状态良好的KMB17细胞洗涤1次,以4.0MOI的毒种进行适应性传代,加入含2%血清的MEM维持液,于37℃、5%CO2培养7d,镜下观察细胞病变(CPE)。培养7d后收毒,反复冻融2次,再以同样方法接种下一代,直至细胞出现病变,CPE达++++,筛选出的能够在KMB17细胞上增殖的毒株检测滴度并于-70℃保存。将筛选出的登革病毒以4.0MOI接种长至单层、状态良好的KMB17细胞,在5%血清浓度的MEM培养基中培养,连续传10代。采用微量滴定法测定每代病毒液感染性滴度。3.4细胞培养和病毒的分离培养利用KMB17细胞对选育出的Ⅲ型登革病毒D9964细胞适应株进行噬斑筛选纯化。弃去6孔板中已生长成单层的KMB17细胞的培养液,用Hanks液漂洗2次。用不含血清的维持液将病毒稀释后以4.0MOI接种细胞,置37℃孵育4h,每隔15min轻轻水平晃动培养板数次,以保证病毒与细胞充分接触。吸附完毕吸出病毒液,加1ml含0.1%中性红,5%胎牛血清的MEM琼脂糖培养基,倒置于37℃5%CO2培养箱中培养。2d之后每天观察2次,记录蚀斑出现和生长情况,直至大小适宜时吸取斑点,以维持液稀释后接种96孔板,收集病变孔的培养液,以上述方法进行3轮蚀斑纯化。3.5实验细胞的扩增用免疫荧光法检测病毒抗原性。以KMB17细胞接种放有玻片的6孔板,长至单层后各2孔细胞以4.0MOI接种登革病毒原液和KMB17细胞第10代适应株,2孔作对照,用含5%血清MEM培养基于37℃、5%CO2条件下培养72h,取出孔里的玻片进行荧光染色。一抗为Ⅲ型登革病毒抗血清,二抗为FITC标记的羊抗人IgG。3.6病毒适应株在细胞中的增殖动态将病毒纯化株接种KMB17细胞,以第3~7d细胞培养上清液提取RNA为模板,通过Real-timePCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。引物为:FP:5′-GCATATTGACGCTGGGAGAGA-3′,RP:5′-GGCGTTCTGTGCCTGGAAT-3′.反应条件:45℃5min合成cDNA;94℃预变性2min;94℃30s,60℃30s,共40个循环;最后72℃延伸7min。结果1rt-pcr扩增以获得的登革病毒基因组RNA为模板,通过RT-PCR对Ⅲ型登革病毒特异性基因进行扩增,获得511bp的登革病毒特异性条带和290bp的Ⅲ型登革病毒型特异性条带。2病毒登格病毒的扩散和滴注量的测定以C6/36细胞扩增收获200mlⅢ型登革病毒,微量滴定法测定病毒感染性滴度为3.50CCID50/mL。3邓氏病毒适用于kb-17细胞的培养登革病毒接种KMB17细胞传至第3代时第7d细胞出现病变,到第12d达+++,证明登革病毒已适应在KMB-17细胞内复制。4病毒感染情况检测结果显示,D9964株在KMB17细胞上连续传代10代,病毒滴度呈持续升高直至稳定的适应过程,传第1和第2代最低,细胞无明显病变,传至第3代时,细胞开始有明显病变,病毒的感染滴度达到2.25CCID50/mL,至第9和第10代滴度最高,达到5.5CCID50/mL。5养基纯化期斑登革病毒在含中性红的MEM琼脂糖培养基上培养,3轮噬斑纯化均在3d后出现微小斑点,至5~6d斑点直径长至约0.8~1mm,此时大小适宜接种。6免疫荧光登革病毒D9964株在KMB17细胞上传代10代后,以Ⅲ型登革病毒抗血清进行免疫荧光染色。结果显示,在接种病毒的细胞内可见明亮的绿色荧光,而对照组细胞内未见绿色荧光,表明选育出的适应株在KMB17细胞中可以增殖并具有良好的抗原性。7不同培养条件对病毒增殖的影响以第3~7d病毒培养物提取RNA为模板检测D9964病毒纯化株在细胞中的增殖动态,Real-timePCR结果显示样品扩增的Ct值随病毒培养时间推移逐渐减小,由于Ct值与初始模板量成反比,因而由扩增曲线可看出病毒接种KMB17细胞后第3d已经开始增殖,在第5~6d增殖最为迅速,在第7d病毒增殖达到最高峰。人源性二倍体细胞的基因文化和免疫部分近年来,由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素,登革热在全世界的发病率提高了近30倍。在过去两年中全球登革热感染人群的数量持续增长,在东南亚中部和南部地区、美国以及南太平洋地区,每年约8000万人感染登革病毒,估计有24000人死亡,超过100个国家的30亿人受到威胁,已成为世界性的公共卫生问题。迄今为止全球仍没有获准上市的登革病毒疫苗,因此登革疫苗研发迫在眉睫。在研疫苗中采用的细胞基质大多为动物源性细胞,包括Vero、PDK、PGMK和FrhL等,这些传代细胞作为培养基质所生产的疫苗产品理论上有致肿瘤的危险,以人源性细胞制备的登革疫苗候选株还未见报道。WHO认为疫苗的生产应首先考虑采用人源性二倍体细胞或已知特性的传代细胞,并应严格控制外源因子的污染。KMB-17二倍体细胞株源于人胚肺组织,对至少71种病毒敏感,且与上述传代细胞相比,在理论上不存在致肿瘤的危险性。此外,初次感染其中一种型别的登革热病毒后,机体会产生针对此型病毒的特异性抗体,如再次感染异型病毒,病毒抗原与抗体形成免疫复合物,与单核/巨噬细胞表面的Fc受体或补体结合,在这些细胞中大量复制并且毒力增强,出现抗体依赖性感染增强作用(ADE),导致血管通透性增加、血浆外渗、血容量减少,血液浓缩和休克等一系列病理变化,这给登革热病毒的疫苗研究带来了很大的挑战和困难。因此理想的登革疫苗需是四价的,要求能诱导同时针对4个血清型登革病毒的均衡的免疫应答,且免疫应答水平应足够高。在前期研究中我们已成功筛选出Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型登革病毒的KMB17细胞适应株,本实验选育出的Ⅲ型登革病毒D9964KMB17细胞适应株将为研究四价疫苗奠定基础。下一步将继续针对KMB17细胞扩增的四种型别登革病毒配比和佐剂的选择进行探索,制备灭活疫苗候选株,同时通过一系列体外实验和动物实验对其免疫原性以及是否引起抗体依赖的增强作用(ADE)进行评价,确保候选疫苗能够产生针对四种血清型登革病毒(