泥螺精子发生的观察

泥螺精子发生的观察

精子发生是发育生物学的重要组成部分之一。对软体动物尤其是重要经济类型的精子发生进行了深入的研究，不仅具有理论上的重要性，而且在人工繁殖中也起着重要的领导作用。国内对腹足类软体动物精子发生的超微结构研究很少(柯才焕和李复雪,1992),而国外研究较多(Azevedo,1986;Buckland-Nicks&Chia,1977;Hodgson&Bernard,1988;Jaramillo,1986;Maxwell,1983),不过均未见泥螺精子发生的相关报道。泥螺(Bullactaexarata)隶属于腹足纲(Gastropoda)后鳃亚纲(Opisthobranchia)头目(Cephalaspidea),是一种营养价值较高的滩涂贝类,也是浙江沿海重要的养殖种类。作者在对泥螺生殖系统的组织学(应雪萍等,2002)及卵子发生超微结构研究(应雪萍和杨万喜,2001)的基础上,进一步对其精子发生的超微结构进行研究,有助于了解泥螺生殖生物学的相关知识,同时也为后鳃亚纲软体动物精子发生过程的研究工作提供基础资料。1生殖腺分离实验所用的新鲜泥螺于2000年3～11月和2001年3～5月,每月1次采自浙江省乐清市黄华养殖场。每次取体长相似而生殖腺处于不同发育阶段的泥螺8只,活体解剖,迅速分离出两性腺。将两性腺切成小块,分别用0.1mol/L?pH7.4磷酸缓冲液配制的体积分数为2.5%的戊二醛和质量分数为1%的锇酸双固定,酒精系列脱水,618环氧树脂渗透并包埋,瑞典LKB2088超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,日立H-600透射电镜观察并拍照。2结果2.1核型异染色核精原细胞(spermatogonium)胞体呈椭圆形,直径4.6～6.6μm,胞质中具少量的线粒体和高尔基囊泡;核较大,直径3.5～5.4μm,核质较分散,核膜清晰,核中异染色质少且分布较为均匀(图版Ⅰ1)。精原细胞经有丝分裂后变圆,直径6.2～6.6μm,核几乎占满整个细胞,细胞核内异染色质呈斑块状,不均匀地分布在核内。胞质中有2～3层内质网绕在核外,游离核糖体出现(图版Ⅰ2),说明精原细胞后期阶段,细胞的代谢活动明显增加。2.2细胞培养法se初级精母细胞(primaryspermatocyte)的胞体稍有增大,细胞呈椭圆形或近圆形,直径7.2～7.8μm。核较大,核径为4.6～6.2μm,并偏向细胞一极,核内染色质多数凝聚成小团块状,具一电子密度很高的核仁,核膜清晰(图版Ⅰ:3～4)。胞质中游离核糖体丰富,溶酶体出现,线粒体数目多,嵴发达,分布在细胞的一侧(图版Ⅰ:3～4),说明初级精母细胞已具有明显的极性。2.3ocyte初级精母细胞进行第一次成熟分裂后产生染色体减半的次级精母细胞(secondspermatocyte)。初级精母细胞在分裂时,胞核先分裂为二,随后胞质分开,因此形成双核细胞,部分胞质间仍以细胞间桥相连(图版Ⅰ5)。胞体比初级精母细胞小,胞径为4.5～6.3μm,核径为3.2～5.1μm。胞质内线粒体数量多,并集中在胞质一侧,极性分布更加明显(图版Ⅰ6)。2.4成为精细胞spermatid次级精母细胞完成成熟分裂的第二次分裂而成为精细胞(spermatid)。精细胞在分化为成熟精子过程中历经一系列形态变化,泥螺精细胞可分为早、中、晚三个时期。2.4.1精细胞早期2.4.2精细胞中期2.4.3精细胞晚期3泥螺精原细胞和精母细胞的形态差异Roosen-Runge(1976)认为:精原细胞和精母细胞的形态变化几乎没有种间差异,而精细胞则具有较大的种间差别。泥螺精原细胞和精母细胞的形态特征,确与其他已报道的腹足类及双壳类软体动物差别不大,但随着精细胞的分化,其差异逐渐增加。这种差异主要集中在核的变化、线粒体数目与行为变化、高尔基体的分泌活动与顶体的形成、以及内质网的变化等几个方面。而精子发生过程中核及细胞器超微结构的变化,可作为分类的依据。3.1精细胞分化和染色质浓缩泥螺精细胞分化过程中出现细胞核和核内物质的显著变化,核由椭圆形变为橄榄球状,再内凹成肾形,最后形成与细胞长轴一致的长圆柱形。这与其他软体动物在精细胞分化过程中核的变化有较大的差异。前鳃亚纲的台湾东风螺(Babyloniaformosae)和Patellidlimpet的核一般由椭圆形成为扁平形,再成长形(柯才焕和李复雪,1992;Hodgson&Bernard,1988)。双壳类软体动物如褶纹冠蚌(Cristariaplicata)、栉孔扇贝(Chlamysfarreri),其精细胞核往往由前期的椭圆形渐渐拉长成后期的圆柱形或子弹头形(邓道贵和谈奇坤,2000;任素莲等,1999);但中国淡水蛏(Novaculinachinensis)精细胞的核形从早期到晚期基本保持同一形态,即近圆形,这种形态一直维持到成熟精子阶段(饶小珍等,2000)。此外,泥螺精细胞早期的核膜出现囊泡化,核膜囊泡化是核孔复合体出现的标志,说明此时期开始,细胞核内外物质交换频繁,核内各种RNA和核糖体通过核孔进入细胞质,以保证细胞大量合成各类蛋白质所需原料的供应。据报道,缢蛏(Sinonovaculaconstricta)的精细胞发生过程也出现核膜囊泡化,但在初级精母细胞时期出现(刘正琮等,1990)。因而,精细胞核的形状变化、核膜有无囊泡化及囊泡化出现的时期可能在系统发育分析方面起一定的作用。在精细胞分化过程中,伴随着核形态的变化,染色质逐渐凝集,亦即染色质表面积不断缩小,而染色质浓缩有种属的差异。泥螺在精细胞分化期间核内的染色质由细颗粒状变为细纤维丝,再变为与细胞长轴平行的长纤维丝状,最后核物质充满核部,呈现致密的均匀分布,使核体积缩小,而保存遗传物质。作者认为,核内染色质的高度浓缩和核体积的减小可能有利于泥螺精子迅速穿过卵膜,提高受精率。Walker(1970)把各种动物精细胞核染色质浓缩后的形态分为三类:颗粒状、纤维状和片状,如台湾东风螺、Chorusgiganteus和Nucellalapillus的精细胞染色质浓缩后形态为典型的片状(柯才焕和李复雪,1992;Jaramillo,1986;Walker&Macgregor,1968)。而某些具有延长的精细胞核的帽贝科种类,其核内的染色质由颗粒状浓缩成纤维状,再成长纤维丝,最后聚集成电子密度高的同源染色质状态(Hodgson&Bernard,1988)。这与本文研究的泥螺精细胞核中的染色质变化较相似,而与上述三种类型不完全相同。Maxwell(1983)认为,软体动物原生型精子核内染色质的浓缩,大多是呈颗粒状,少数是纤维状;并认为颗粒状染色质最小,而且发生在精核较短的种类,同时纤维状染色质发生在具有延长精核的种类,但其延长核的发生机制目前尚不清楚。Fawcett(1971)的研究结果认为,染色质浓缩模式是影响精子头部形态的最重要过程。本研究结果也表明,染色质浓缩后的形态结构与精细胞核的形状有密切的关系,并认为精细胞染色质浓缩后的形态不能简单归为三类,应具种的特异性,对分类学有一定价值,但尚待进一步系统研究。3.2泥螺精细胞不同发酵期糖精图像的变化泥螺精原细胞时期,线粒体分布较分散,数目少;到精母细胞时期,线粒体数量明显增多,并多数分布在细胞一端。线粒体是细胞生命活动的供能者,精母细胞时期线粒体的大量出现与细胞的进一步分化有关。从这一时期起,细胞生命活动越来越旺盛,需要大量的能量。泥螺精细胞时期线粒体数目逐渐减少,而体积逐渐增大,嵴数目增多。线粒体体积增大和嵴数目增多的现象表明,精子在成熟过程中逐步积累能量,为精卵结合做准备。泥螺精子发生过程中线粒体数目从少到多再到少的变化,反映了各阶段生理活动的旺盛程度。3.3粗面内质网-甲基复合材料的分离和分离泥螺精子发生过程中,高尔基体的分泌活动十分旺盛。在精原细胞和精母细胞时期,胞质中出现少量的高尔基囊泡;到精细胞早期,高尔基囊泡数量较多,并在精细胞核顶端出现前顶体囊,在后续的精细胞分化过程中,高尔基复合体仍很发达。这种现象与台湾东风螺和Patellidlimpet等动物精子的顶体形成过程基本一致(柯才焕和李复雪,1992;Hodgson&Bernard,1988),只是不同动物前顶体囊的形成时期稍有区别。泥螺顶体物质的合成发生在内质网较丰富的精细胞时期,说明内质网与顶体物质的合成和包装有关。在早期精细胞阶段,细胞质中有绕核分布的粗面内质网,随着精细胞的进一步分化,部分粗面内质网囊泡化,囊泡内充满电子密度较高的内含物。精细胞后期,内质网逐渐消失,高尔基体失去了物质来源,不可能再合成和分泌前顶体颗粒,因此大量的前顶体颗粒是在早、中期精细胞中合成的。内质网囊泡参与顶体形成的功能为许多十足目动物所具有(康现江等,2000),但在软体动物中,仅见Longo&Dornfeld(1967)报道了粗面内质网-高尔基复合体系统与前顶体颗粒出现有关。从泥螺的精子发生过程中可进一步证实,粗面内质网和高尔基复合体能共同参与前顶体物质的合成作用。早期精细胞形状不规则,核呈橄榄球状,核径为2.2～3.9μm,核内染色质呈絮状密集分布,部分核膜囊泡化,并扩张成明显的核周隙(图版Ⅱ:1～2)。粗面内质网包围着核及线粒体的周围,高尔基囊泡数量增多,前顶体囊泡已形成(图版Ⅱ2)。中心粒开始出现,并逐渐移向核后端。胞质中线粒体数目多,嵴丰富,集中排列在核的一侧,溶酶体较丰富(图版Ⅱ:2～3)。中期精细胞的核中部逐渐凹陷成肾形,染色质呈细丝状密布在核中。中心粒位于核的凹陷处,标志着尾鞭形成的开始,线粒体逐渐移向核后端,并出现融合现象(图版Ⅱ4)。此期轴丝已明显形成,线粒体围绕轴丝排列,胞质中具丰富的、大小不同的高尔基囊泡和内质网囊泡,前顶体囊中出现前顶体颗粒物质(图版Ⅱ5)。随着精细胞的进一步分化,胞质中的线粒体进一步融合,结果成为数量少、体积甚大的线粒体集合体(图版Ⅱ6);核内染色质进一步凝集成丝状,前顶体囊内颗粒物质明显增多,高电子密度的核糖体颗粒分散或成簇地散布于细胞质中,高尔基囊泡和内质网囊泡仍很发达(图版Ⅲ1)。精细胞核的形状沿着顶体囊—中心粒—线粒体轴伸长,染色质浓缩为长丝状,与核的长轴方向一致