表观遗传学在登革病毒中的应用

表观遗传学在登革病毒中的应用

病毒登格病毒是一种重要的蚊媒病毒，会导致登格热和重登格热。其中，重登格热的死亡率很高。流行病学调查显示登革热的感染人数呈增加趋势,近期广州、云南等地都有流行。关于登革热的发病机制至今尚未完全研究清楚。诸多报道显示表观遗传学在病毒感染中起重要作用,但关于其在登革病毒感染方面的研究则较少,针对此方面的研究可能对登革热的防控和临床治疗起到一定的作用。本文将从以下几个方面综述表观遗传学在登革病毒感染中的研究进展。1重症登革热登革病毒(denguevirus,DENV)属于黄病毒属,为单正链RNA病毒,可分为4种血清型(DENV14),由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播,病人和隐性感染者是其传染源。登革病毒可引起登革热(dengufever,DF)、登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克综合征(dengueshocksyndrome,DSS),后两者称为重症登革热。最新的文献报道登革病毒感染人数每年约有39000万人。登革热的发病机制至今尚未完全清楚,已经提出的相关假说有病毒变异、病毒亲嗜性、病毒毒力学说、宿主的易感因素、抗体依赖性增强感染作用(antibody-dependentenhancement,ADE)、病毒抑制型干扰素介导的抗病毒反应、T细胞的异常活化、交叉反应性T细胞反应、细胞因子风暴等。重症感染时会出现细胞因子风暴,即过量的促炎症细胞因子的释放导致免疫病理组织损伤和机体功能异常的现象。2遗传因素2.1表观遗传检测细胞的表达在基因序列不发生改变的情况下,基因表达也可以发生可遗传的变化,表观遗传学(epigenetics)是一门研究这种变化的遗传学分支学科。这种可遗传的改变是由可遗传物质发生改变引起的。可遗传的物质是指细胞内除遗传信息以外的物质,这种物质可以在机体发育和细胞增殖过程中稳定传递。表观遗传学研究内容包括基因选择性转录表达调控和基因转录后调控,其中前者包括DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白修饰和基因修饰,后者包括基因组非编码RNA、miRNA等。表观遗传学是非基因序列改变导致基因表达水平变化,这与研究基因序列改变导致基因表达水平变化的遗传学是相对应的概念。近期研究发现表观遗传学的机制广泛参与生命发育、肿瘤发生、炎症反应、血管生成、病毒感染等多种生理或病理活动。2.2mirnasc在细胞生物学和表观研究上的作用MicroRNA(miRNA)是一类大小主要为18~25nt的具有高度保守性的内源性基因编码的非编码单链RNA分子,没有免疫原性,参与转录后表达调控。在细胞核内,位于CpG岛后部的DNA在RNA聚合酶Ⅱ的参与下,转录形成70~100nt的primicroRNA。Pri-microRNA具有颈环结构,其3’端有多聚腺苷酸尾巴。之后,经历微处理器复合体(核糖核酸酶Ⅲ、Drosha和双链RNA结合蛋白DGCR8)的处理和Dicer酶的剪切,最终形成成熟的、18~25nt的miRNA。在细胞胞浆内,miRNA与mRNA在Argonaute蛋白的参与下形成miRNA介导的沉默复合体(miRNA-inducedsilencingcomplex,miRISC)。MiRISC可在miRNA的指引下特异性地识别并结合mRNA分子3’端约30nt长度的非编码区,抑制mRNA的翻译或是使mRNA降解。这种结合通常是不完全配对,这也使得一个miRNA分子可以和多个mRNA结合,使miRNA的调节具有普遍性。MiRNA对人类至少1/3基因的表达都可以起到调节作用,其作用靶点是mRNA分子3’端的非编码区,但是在调节生长发育时偶尔会作用于5’端的开放阅读框。MiRNA可对表观调控子的表达进行调控,但表观调控子(如EZH2、Bmi1、YY1、HDACs、DNMT3A/B、MeCP2等)亦可针对编码miRNA的基因,或对编码与miRNA表达相关酶类的基因进行调控,从而达到调控miRNA的目的。可见,在miRNA和表观遗传学信号通路间有复杂的反馈调节网络,组织整个基因表达谱;当调节回路被破坏时,机体正常生理功能被干扰,便会造成各种疾病过程。这里复杂的反馈调节所构成的调节回路对人体的生理和病理反应有重要意义。3感染和表观遗传3.1hbv突变基因与转录水平目前,有关基因转录表达调控与病毒感染的文献报道,多集中于乙型肝炎病毒(HBV)和人乳头状瘤病毒(HPV)。HBV是一种部分双链环状DNA逆转录嗜肝病毒,与肝细胞癌的发生存在强相关性。Herceg等证明,在HBV感染机体后,DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA介导的基因沉默等表观调控机制由于机体或环境因素会“放松”对一些特定基因的管制,这种表观调控功能的下调会促进肝细胞癌的发生和发展;Ozen等对HBV引起的肝癌患者的基因谱进行研究,发现常见的癌症突变基因P53、CTNNB1、AXIN1、CDKN2A等的突变频率较低,但环状DNA甲基化、启动子甲基化、非编码RNA表达异常、其他表观调控子如EZH2的表达失调等表观遗传学的异常则较为明显,这有助于确定肝癌的新型生物标志和治疗靶点;Lambert等与HernandezVargas等的研究表明,与正常肝组织相比,出现GSTP1、RASSF1A、CHRNA3、DOK1等基因异常的高频率甲基化的组织出现更典型的肿瘤特异性形态,并且在肿瘤的不同发展阶段均表现出特定的DNA甲基化现象,这有助于肿瘤的临床诊断与分型。可见转录水平的表观调控在HBV的复制,以及HBV诱导的肝细胞癌的发生和发展中均起到重要作用。人乳头状瘤病毒(HPV)是一种球形DNA病毒,属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属,与宫颈癌的发生发展息息相关。宫颈癌是一种常见的恶性肿瘤,但其具体的发病机制至今未研究清楚。过去人们普遍认为基因突变特别是抑癌基因的突变是发生肿瘤的关键因素,但是随着研究的不断深入,越来越多的证据表明抑癌基因的启动子区CpG岛的异常甲基化及组蛋白修饰等表观遗传学改变在肿瘤的发生和转移中起重要作用。之前已有报道指出在宫颈癌中存在HDAC1和HDAC2的过度表达。Farkas等证实在宫颈癌细胞中免疫相关的基因会发生低甲基化。新的研究证实HDAC抑制剂AR-42和CRT/E7DNA疫苗共同免疫小鼠比各自单独免疫表现出更强的抗肿瘤性。HPV感染与转录表达调控的研究为宫颈癌的治疗提供了新的思路。3.2通过自身编码mirnas方式改变细胞表达现有研究表明,miRNA在细胞凋亡、肿瘤发生、胚胎发育、干细胞分化、炎症反应、生长发育、病毒感染等方面均发挥重要作用。在病毒感染时,细胞自身编码的miRNA可以促进或者抑制细胞内病毒的复制,对病毒的生存和复制具有双重性的意义;而病毒也可以自身编码miRNA,或者通过某些途径改变体细胞miRNA的表达谱系。有文献报道,HBV病毒自身并不能产生miRNA,但可以调节宿主细胞有关的miRNA表达,影响特定miRNA的转录;另一方面宿主细胞产生的miRNA又能影响病毒的活性。Wilting等发现在严重的子宫颈上皮非典型增生组织和癌组织中有32种miRNAs呈现低表达,并且证明HPV病毒能够引起hsa-miR-149、hsa-miR-203、hsa-miR375甲基化水平增加,从而影响这三种miRNAs的表达。MiRNA以基因沉默的方式调节宿主和病毒的基因表达,从而改变病毒免疫原性造成免疫逃逸;或改变宿主的细胞微环境,包括在表观遗传学的层面调节细胞因子的表达量,使宿主细胞更适于病毒的生存和复制。4病毒登格化感染和表观遗传因素4.1促进aadnnt2表达关于基因转录水平的表达调控与登革病毒感染的报道较少。有研究指出人原代单核细胞感染登革病毒48h其IL8启动子区H3和H4的乙酰化增加,并证实这种改变影响IL8的表达;Zhang等发现登革病毒感染埃及伊蚊会引起宿主AaDnmt2表达增加,而宿主体内AaDnmt2表达升高又会促进登革病毒的复制;Selisko和Dong等发现登革病毒的非结构蛋白NS5具有甲基转移酶活性,能使病毒基因组RNA5’端保守的帽子结构GpppACn甲基化生成7MeGpppACn,从而调节宿主与病毒之间的相互作用。本实验室对登革病毒感染的外周血单个核细胞的细胞因子表达水平进行测量,发现CCL5、IL-6和IL-8的表达水平均显著升高,而TNF-α的表达水平下降。之后的研究证实DENV2感染会引起TNF-α基因启动子区域的甲基化水平增加,其甲基化水平改变的具体机制尚待进一步研究。4.2mirna在登革病毒感染中的作用目前对于转录后的表观调控与登革病毒感染的相关研究已取得一定的进展。据文献报道,利用RNA干扰技术,干扰连接受体的表达,抑制网格蛋白介导的内吞作用,成功地阻止了登革病毒进入HepG2细胞,并抑制了病毒的复制;郑学礼等使用含有Ⅱ型登革病毒前膜蛋白(prM)基因反向重复序列的重组质粒,转染进入病毒靶细胞,使病毒复制受到抑制;Brian等发现,插入黄病毒属病毒相应靶点的miRNA可改变病毒的嗜神经毒性,限制病毒进入免疫缺陷小鼠的中枢免疫系统的能力,并能增强正常小鼠的体液免疫应答能力;Hussain等使用沃尔巴克氏体(Wolbachia)与埃及伊蚊共生,发现沃尔巴克氏体能够诱导宿主细胞表达aae-miR-2940和aae-miR-981,其中前者可以调节甲基转移酶的转录,后者可以干扰Argonaute蛋白在细胞内的分布调节RNA干扰,从而抑制登革病毒在蚊子宿主体内的复制;Skalsky等通过基因组学分析和高通道测量技术,发现黄病毒属病毒感染白纹伊蚊和致倦库蚊时,在那些能够介导病毒感染的蚊子宿主中,miR-92和miR-989的表达水平变化明显,并且证实了超过60个保守miRNA和7个新的昆虫miRNA存在表达变化;Wichadakul等利用miRNA的反应元件试验(microRNAresponseelements,MREs)确定miRNA结合点和有效的突变,从而基于miRNA的基因沉默机制,控制病毒复制,进而设计安全高效的减毒活疫苗;Kakumani等发现登革病毒的NS4B基因的表达产物可以通过其位于中央的TMD3和C-末端的TMD5跨膜结构域抑制宿主细胞的RNA干扰过程,对于病毒的复制和识别具有重要意义。本实验室对登革病毒感染的外周血单个核细胞的miRNA表达谱进行生物信息学分析和芯片分析,发现差异表达的miRNA中,有11个,即miR_4290、miR_4279、miR_625、hsa_let_7e、miR_1290、miR_3