乙脑病毒prme基因的克隆及表达

乙脑病毒prme基因的克隆及表达

病毒登甲病毒（dv）是黄毒科黄毒科重要成员。它分为四种类型。它可以通过蚊子传播，引起人的革兰氏热。症状包括高烧、头痛、肌肉疼痛、关节和皮疹。据WHO估计,全球有25~30亿人口面临登革病毒感染危险,每年有大约5千万至1亿登革热(Denguefever,DF)病例出现,其中50万病例发展成严重形式的登革热,即登革出血热(Denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克综合征(Dengueshocksyndrome,DSS),全球每年因登革病毒感染死亡的人数是2.5万。但是目前尚无有效预防DV感染的疫苗。由此,登革病毒疫苗也一直是各国学者的研究焦点之一。近60年来,登革疫苗研制工作持续进行,目前,已经存在关于登革疫苗的多个报道,其中报道的登革疫苗形式包括灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗、核酸疫苗、腺病毒载体疫苗。近年来以弱毒黄病毒为基因骨架构建嵌合病毒成为研究登革病毒疫苗的一个新思路。乙脑病毒(Japaneseencephalitsvirus,JEV)SA14-14-2株是我国自行研制的减毒活疫苗。本论文作者所在研究组已成功构建乙脑病毒疫苗株SA14-14-2的复制子并证实该复制子具有自主复制能力和表达外源蛋白的能力。本研究在此基础上构建了感染性乙脑/登革2型嵌合体克隆,拯救得到乙脑/登革2型嵌合病毒并且对其鉴定,研究结果现报告如下。材料和方法1试剂与检测方法DV2(NGC株)由本研究室保存;JEVSA14-14-2株复制子载体pPartial△prM/E由本室构建;BHK-21细胞、C6/36细胞为本研究室保存;TRIzolReagent、SuperScriptIII第一链合成试剂盒、PlatinumPfxDNA聚合酶为Invitrogen公司产品;限制性内切酶、T4DNA连接酶系Biolab公司产品;DNA纯化试剂盒是QIAGEN公司产品;质粒提取试剂盒为Omega公司产品;体外转录试剂盒RIBOMAXlargescaleRNAproductionsystem及Ribom7GcapAnalog为Promega公司产品;DV2重组EⅢ蛋白免疫的兔血清由本室制备;FITC标记抗兔IgG抗体,HRP酶标抗兔IgG抗体为Sigma公司产品。引物合成由上海生工生物工程公司完成。2dv2prm/e基因的扩增与纯化我们在构建JEV复制子时,删除prM/E基因并同时保留E蛋白羧基端的71个氨基酸(213bp)。因此,本试验中扩增DV2prM/E基因时,截去了3′端的213bp。DV2的prM/E基因以DV2病毒全长基因组cDNA为模板,使用PlatinumPfxDNA聚合酶,用以下引物进行PCR扩增:上游引物5′-accggtTTCCATTTAACCACA-3′(小写字符部分为引入的AgeI限制性酶切位点);下游引物5′-cccgggGGATCCAAAATCCCAAGCTG-3′(小写字符部分为引入的XmaI限制性酶切位点),扩增条件为:94℃预变性30s,94℃15s,52℃30s,68℃2min,共25个循环,68℃延伸10min,4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并纯化和回收。回收产物加A尾后连接至T载体。目的TA克隆经酶切鉴定及测序正确后备用(测序工作由北京三博远志生物技术有限责任公司完成)。含DV2prM/E基因的目的TA克隆经AgeI和XmaI双酶切处理,回收目的片段。回收的目的片段与经相同酶消化的pPartial△prM/E定向连接,连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue。阳性质粒通过小量制备法制备并经酶切法进一步鉴定,获得的重组质粒命名为pJEE-1770。3体外转录nd-pcr反应体系质粒pJEE-1770经SalI线性化并纯化后,利用Promega的RIBOMAXlargescaleRNAproductionsystem在组成如下的100μl反应体系中体外转录成RNA:5×转录缓冲液20μl、rNTPs30μl(rATP25mmol/L、rCTP25mmol/L、rUTP25mmol/L、rGTP8.33mmol/L)、m7Gcap5μl、酶混合物(T7)10μl、线性化pJEE-1770质粒35μl(15~25ng/μL)。反应体系在37℃孵育4h后,加入2μlDNA酶并在37℃孵育20min,以消除模板DNA。体外转录物用QIAGEN公司的RNeasyMiniKit纯化,定量、分装并保存在-70℃。4细胞电穿孔转染将1只T25方瓶中贴壁长满的BHK-21细胞用10%胰酶消化法处理,用含10%FBS的DMEM培养液重悬细胞,以400g离心5min;用无菌冷PBS洗细胞2次,将细胞重悬于400μlPBS中,加入10μg前述体外转录的RNA并充分混匀后,立即在BioradGenePulser中以电穿孔法转染。电穿孔转染的参数是:电压850v、电容25μF、电阻∞、脉冲两次。电击后的细胞置于冰上5min,立即转移至预先加入2.5ml含10%FBS的DMEM培养液的六孔板中,在37℃培养,待细胞贴壁后更换细胞培养液一次。按照相同方式处理的正常BHK-21细胞为阴性对照。逐日观察细胞形态。5分离人细胞及细胞形态观察转染的BHK-21细胞出现CPE后,将该细胞连同培养液反复冻融3次,4000rpm离心10min。取0.5ml上清液分别接种在T25方瓶中传代的BHK-21细胞及C6/36,分别在37℃和28℃吸附1h后,加入含1%FBS的细胞维持液继续培养,并逐日观察细胞形态。获得的嵌合病毒命名为JED21770V。6基于生物酶活性的cdnapcr检测从接种JED21770V并出现CPE的C6/36细胞培养物中提取总RNA并将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板,用以下引物:Pf5′-CGAGAACTTGGAACACTCATTGACG-3′Pr5′-GCGCTTTGTGGACGATCTTCGCTAG-3′实施PCR扩增。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收、纯化并送测序。7制备产物叶片将接种JED21770V并出现CPE的C6/36细胞经胰酶消化法处理后,以机械方式吹下,用PBS洗涤2遍。细胞重悬于PBS中,制备抗原片,用丙酮固定15min。抗原片以DV2重组EⅢ蛋白(E蛋白的第三结构域)免疫的兔血清为第一抗体(用PBS稀释至1:200),FITC标记羊抗兔血清为第二抗体(1:100)按常规间接免疫荧光操作步骤处理后在荧光显微镜下观察。8sds-东南角电泳将细胞裂解液(50mmol/LTris·Cl,150mmol/LNaCl,0.1%SDS,100μg/mLPMSF,1μg/mLAprotintin,1%NP-40,0.5%去氧胆酸钠)添加至接种JED21770V并出现CPE的细胞,随后在冰上放置30min。取40μl裂解混合物与10μl5×上样缓冲液混合,煮沸3min,在12000r/min离心10min。所得上清液进行SDS电泳,随后将电泳后凝胶中的蛋白质经半干式电转移法转移至PDVF膜上。以DV2重组EⅢ蛋白免疫的兔血清为第一抗体(1:200),HRP标记羊抗兔血清为第二抗体(1:2000),DAB为显色底物,对前述PDVF膜实施常规Westernblot检测。结果1目的片段的核苷酸测序结果以DV2病毒cDNA第一链为模板,用PCR扩增prM/E基因,得到大小1770bp的目的扩增片段。测序结果显示,所得目的片段的核苷酸序列与DV2NGC株的核苷酸序列完全一致,同源性为100%(结果未显示)。含prM/E基因的TA克隆质粒经前述双酶切处理,回收的目的片段克隆至质粒pPartial△prM/E。所得的重组质粒pJEE-1770经酶切鉴定符合预期(结果未显示)。2brk-21细胞上原因的检测pJEE-1770的体外转录物转染BHK-21细胞后5~7d可观察到典型CPE,即细胞变圆、脱落,与DV2及JEV在BHK-21细胞上引起的CPE相似(图1)。将收集的第一代病毒在BHK-21细胞中连续传代,结果盲传5代均不能检测到病毒。而在C6/36细胞中培养的嵌合病毒JED21770V可使细胞在感染4d左右出现典型病变,表现为细胞的肿胀和聚集,与DV2及JEV在C6/36细胞上引起的CPE相似,但是对该细胞的聚集效应在程度上不及亲本毒株DV2及JEV(见图2)。3pcr检测dv2prm/e、jevc及ns1的表达从接种第二代JED21770V并出现CPE的C6/36细胞中提总RNA并反转录合成cDNA。以此cDNA为模板,用针对嵌合病毒prM/E基因两个侧翼区所设计的引物实施PCR扩增,结果获得大小约2100bp的扩增片段,与预期一致。以体外转录获得的转染前RNA为阴性对照,结果未扩出预期片段,表明DNA模板已消化完全。将扩增的片段测序,测序结果经比对后,表明该扩增片段是DV2prM/E与JEVC及NS1的嵌合基因。我们在构建嵌合体克隆时,为便于克隆外源基因,在prM/E基因两侧引入了AgeI及XmaI两个酶切位点,测序时均测到这两个遗传标记(结果未显示)。4蛋白免疫因子检测以第三代嵌合病毒感染的C6/36细胞制备抗原片,以DV2重组EⅢ蛋白(E蛋白第三结构域,含多个抗原表位)兔免疫血清为第一抗体,可检测到特异性荧光,说明登革病毒的E蛋白表达。JEV感染的C6/36细胞及正常C6/36细胞均不与这种抗血清反应。间接免疫荧光鉴定结果见图3。5dv2抗体的制备嵌合病毒JED21770V感染的C6/36细胞裂解液以Westernblot进行鉴定,其中以DV2重组EⅢ蛋白免疫的兔血清为第一抗体,DV2感染的C6/36细胞裂解液为阳性对照。鉴定表明,在60kD分子量标记处均可见到预期条带。Westernblot鉴定结果见图4。以den4为分子的嵌合病毒的诱导表达乙脑病毒与登革病毒同为黄病毒科黄病毒属成员,是单股正链RNA病毒,基因组长约11kb,含单一开放读码框。黄病毒科成员的基因结构较保守,其基因组中编码区及非编码区(NCR)的排列顺序为5′NCR-C-PrM/M-E-NS1-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR-3′),其中E基因编码的E蛋白是病毒的表面包膜糖蛋白,具有结合靶细胞表面受体\介导膜融合、诱导中和抗体产生等重要生物学功能,是病毒的最重要的抗原成份。PrM基因编码的PrM/M蛋白也认为是诱导中和抗体产生的抗原成分。非结构基因及非编码区主要与病毒复制及病毒蛋白质翻译有关。1991年,Bray以DEN4814669cDNA克隆为骨架,用DEN1WP株的结构蛋白基因C-prM-E和DEN2NGC株的prM/E置换DEN4的相应基因后获得表达DEN1和DEN2结构蛋白的嵌合病毒,开辟了黄病毒嵌合病毒研究的新领域。目前有关黄病毒嵌合病毒的研究多以弱毒株作为基因骨架,将弱毒株的结构蛋白基因替换为目的基因,从而获得表达目的基因与结构蛋白的嵌合体。嵌合体以活病毒的形式递呈保护性抗原,可诱导较强的体液免疫和细胞免疫。目前使用较成功的载体系统是黄热病毒减毒株YF-17D及登革病毒减毒株DEN2PDK-53。以YF-17D为载体构建的DV1~4型嵌合体病毒具有毒力弱、免疫原性强的特点,并且将很快进入Ⅲ期临床试验评价。我们在前期研究中,构建了JEVSA14-14-2株的感染性克隆,并在此基础上删除结构蛋白prM/E基因,从而构建了便于外源基因克隆的JEV复制子。本研究在上述工作的基础上,在JEV复制子中插入DV2的prM/E基因,并在BHK-21细胞中成功拯救出乙脑/登革2型嵌合病毒。拯救的嵌合病毒经RT-PCR、IFA、Westernblot等方法鉴定后证实具有嵌合核酸,并且能够表达DV2的包膜蛋白。本研究的嵌合病毒可以在C6/36细胞中连续传代,并且可以使C6/36细胞产生与亲本毒株类似的肿胀、聚集等病变效应。但是将拯救的第一代嵌合病毒在BHK-21细胞中盲传5代,每代都不能检测到病毒,这说明尽管嵌合病毒可以在BHK-