冻融和获能处理中猪精子前顶体蛋白转化过程的比较

冻融和获能处理中猪精子前顶体蛋白转化过程的比较

低冷冻精子的受精率是由于一些精子在冷冻和冷冻过程中受到低温破坏的结果。此时，损伤还包括可萃取物质的变化，这些过程被称为低温反应。据报道,精子顶体内含有水解蛋白酶和磷酸脂酶等多达24种酶类,其中顶体蛋白(acrosin)与受精关系最为密切。研究证实鲜精子中85%～90%的顶体蛋白以顶体素原或前顶体蛋白(proacrosin)的形式存在。新鲜精子proacrosin(55和53kDa)自动激活转化成α-acrosin(45～49kDa),然后转化成成熟的顶体蛋白β-acrosin(34～38kDa)。精液冻融过程及冷冻保护剂对精子都有不同程度的影响,顶体酶活性可在精液冻融后下降,说明冻融过程可能对精子的受精潜力有一定影响。Acrosin既有识别卵母细胞透明带的能力,又有融化穿透透明带的能力,而低温损伤的精子既不能识别卵母细胞也不能穿透透明带,从而失去受精能力。本研究的目的是检测冻融后顶体完整的精子与获能精子间proacrosin转化机制,从而提高精液冷冻效率,为改良精液冷冻技术提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面1猪溶液精液由韩吉牧业有限公司提供,采用人工手握采精法,取自8头成年杜洛克公猪。2抗鼠iggh+1均购自Sigma(除另有指定)。抗顶体蛋白单克隆抗体(ACR-2)、酶标(HRP)羊抗鼠IgGh+1购于上海优宁维生物科技有限公司;预染蛋白质Marker、NC膜、DAB显色液等免疫印迹药品均购于北京华美生物科技有限公司。3不同培养条件添加不同卵黄的社区液冷冻液:Tris2420mg,柠檬酸1480mg,葡萄糖1100mg分别加入到100mL三蒸水。冷冻稀释液A:在冷冻基础液中添加20%(v/v)的卵黄,现用现配;冷冻稀释液B:在冷冻稀释液A中加入9%(v/v)的甘油,现用现配。4kcl22h2o100mL溶液中含661mgNaCl,22.3mgKCl,110.2mgCaCl2·2H2O,198mg葡萄糖,55mg丙酮酸钠,200mg咖啡因。以上所有药品均用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤消毒,保存在4℃冰箱中待用。5精子荧光染色抗体稀释液:将500μLTween20加入到1000mLPBS中,混合均匀,过滤后保存待用。一抗的稀释:将一抗(抗顶体蛋白单克隆抗体)先与抗体稀释液按照1∶50比例稀释以备精子荧光染色使用,如需Westernblotting时,再按照1∶4比例稀释,注意避光,保存在4℃冰箱中。二抗的稀释:将二抗(HRP羊抗鼠IgGh+1)与抗体稀释液按照1∶5000比例稀释,避光保存。1.2方法1管水平摆好、盖好、是管水平的保护装置冷冻过程:将托架放到液氮面以上3cm,盖上容器平衡10min。将细管水平摆好放在托架上,盖好保温盖,使其在液氮面上熏蒸10min,之后迅速浸入液氮内保存。解冻过程:将细管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴中,解冻60s,待其解冻后擦干细管上水珠,剪断封口粉的一端,待测精液质量。2心静离心,除精子悬浮将精子获能所需清洗液mPBS和获能液室温下平衡20min。精子获能时取预处理精液,按1∶1添加mPBS,轻轻摇匀后离心(500r/min,5min),弃上清;同样加入2mL获能液,使沉淀精子悬浮;待精子悬浮后第2次离心(500r/min,5min),弃上清,在沉淀精子中加入2mL含有肝素(20μg/mL)的获能液,置于39.0℃,5%CO2培养箱中呈45°倾斜,孵化2h,采用精子上浮(Swim-up)法获能。3次肌肉沉降取预处理精液,150r/min离心10min(4℃),取上清精液6mL,沉淀用6mL过滤水再冲洗;150r/min离心10min,运除底层精原细胞,取上清精液6mL;分别3000r/min离心10min,弃上清液5mL,向底部沉淀中加入3mL预冷的PBS缓冲液(0.1mol/L,pH值7.4,含0.7%NaCl)混匀,对称合并;3000r/min离心10min(4℃),弃上清缓冲液,向底部加预冷的6mLPBS缓冲液;3000r/min离心10min(4℃),弃上清缓冲液,再向底部精子中加入6mL预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH值7.4,含0.7%NaCl,1mmol/LEDTA,0.5mmol/LPMSF),4℃静置15min;3000r/min离心10min(4℃),弃上清反复2次。最后用1mLTris-HCl悬浮精液。向精子悬浮液中加入3倍体积含1%TritonX-100的膜蛋白提取液,冰浴振摇1.5h;4℃,5000r/min离心15min,收集上清精子膜蛋白溶液。42统计分析所得数据用SPSS11.5软件分析,差异显著标准为P<0.05。2结果与分析2.1精子荧光区域3份处理组精子都有荧光出现(图1,A:新鲜精子,B:冻融精子,C:获能精子),获能组精子荧光区域大于冻融组精子,而小于新鲜精子组。结果表明,冻融组精子前顶体蛋白在冻融过程中有一部分受到破坏,前顶体蛋白在获能过程中部分被激活。2.2蛋白的分布经SDS分析,各处理组样本的蛋白质都被分离出来,其中鲜精组蛋白大部分分子量为95～55kDa,而获能组和冻融组的蛋白种类分布较为均匀,有新条带产生的同时也有部分条带消失。表明处理组无论是蛋白种类还是表达水平与对照组相比都发生较大的变化(图2,M.标准蛋白,1.新鲜精子,2.冻融精子,3.获能精子)。2.3冻融和获能组精子的检测将新鲜精子、冻融精子和获能精子样本进行SDS电泳,然后进行Western免疫印迹分析。新鲜组精子出现45和35kDa2条条带,而冻融和获能组精子都同时出现45、35和28kDa3条条带。在冻融和获能过程中Proarosin都被活化成α-acrosin、β-acrosin和28kDa蛋白表达,表明冻融后顶体完整的精子与新鲜精子一样能够正常受精(图3,M.标准蛋白,1.新鲜精子,2.冻融精子,3.获能精子)。3种免疫印迹Kennedy等(1989)以改良的方法检测精子acrosin水平,结果稀释精液和冻融精液的acrosin水平有显著差异,表明冻融精子顶体不同程度受到破坏,有部分acrosin流失到精液中。另有报道体外获能过程中,新鲜和冻融精子acrosin释放和acrosin活性有差异。因此,增强透明带蛋白与顶体完整的精子顶体区结合是精子受精的先决条件。本试验将冻融后顶体完整的精子样本进行SDS分析后,用抗acrosin单克隆抗体与酶标二抗进行处理,通过对Western免疫印迹分析可知,新鲜组精子大约45和35kDa的2种蛋白表达,而冻融和获能组精子大约45、35和28kDa的3种蛋白表达,表明在冻融和获能过程中部分proarosin被活化成α-acrosin和β-acrosin。在获能和顶体反应精子重proacrosin/acrosin系统仍然大比例为proacrosin,而冻融精子proacrosin活化成β-acrosin的时机比新鲜精早。冻融和获能处理组中发现28kDa蛋白。Hardy,etal首次证实28kDa蛋白存在于豚鼠精子中,这种蛋白质广泛被acrosin蛋白水解,而这个过程与顶体基质溶解密切相关。有研究表明,28kDa蛋白与proarosin和49kDa(α-acrosin)结合,而不与36kDa(β-acrosin)结合,维持顶体基质完整和控制顶体反应的精子acrosin释放,但降解机制有待于进一步研究。猪精子acrosin的活性不受品种影响,但表现出明显的季节性变化。α和β-