大鼠脑缺血再灌流模型的建立

大鼠脑缺血再灌流模型的建立

通过实验脑损伤再流，证实缺血组织有病理改变，细胞有死亡。死亡形式随脑组织缺血的严重程度而不同，缺血程度较轻的部位大多出现细胞凋亡，而缺血程度较重的部位则出现细胞坏死。研究较多的是海马，因为缺血后的海马，尤其是CA1区是脑内对缺血缺氧最敏感的区域，是形态学改变和神经细胞死亡最显著的部位。下丘脑室旁核也是脑内很重要的核团。它对缺血缺氧的耐受性如何直接影响到室旁核神经元的功能。室旁核（paraventricularnucleus,PVN）是下丘脑最显著的核团之一，其大细胞（magnocellular）主要分泌加压素和催产素，调节机体的生理功能。大细胞的病变会引起机体生理功能的改变。本实验选择室旁核大细胞作为实验性脑缺血的研究对象，观察其缺血再灌流后在不同时间内的形态学改变，以此证实脑缺血对室旁核大细胞的影响，为机能学的研究提供形态学依据。1材料和方法1.1动物健康Wistar大鼠，24只，体重（230±20)g，雌雄不限。购于中国人民解放军农牧大学实验动物中心。1.2大鼠脑缺血，活检阻断Wistar大鼠双侧颈总动脉建立大鼠脑缺血模型。0.3%硫喷妥钠0.3ml腹腔注射麻醉。70%酒精消毒，作颈正中切口，在胸锁乳头肌和舌骨下肌群之间，从气管两侧挑出颈总动脉，轻轻分离出迷走神经，将丝线从颈总动脉的下方穿过，当两侧均分离出来之后，用丝线将颈总动脉提起，用动脉夹夹闭，使脑缺血30min，然后放开动脉夹，脑血流再通，缝合切口。采用Longa评分法，将缺血成功的大鼠筛选出来，分为3d、5d、7d3组，每组6只。同时，设一假手术对照组（6只）。每一组中，5只用于常规病理观察，1只用于电镜观察。1.3脑梗死超早期溶血法lilie大鼠在再灌流后相应时间点取出脑组织。方法：经心脏灌流固定。先用37℃的生理盐水将血液冲洗干净，后灌注固定液，每只200ml。随即取脑，修块（冠状面切两刀：视交叉之前和大脑脚），中间部分投入固定液中后固定3～6h(4℃）。用于常规病理的采用Lillie氏AAF固定液，即40%甲醛液10份、冰醋酸5份、无水酒精85份。用于电镜的采用4%多聚甲醛、0.25%戊二醛固定液。1.4通光镜观察、照片组用于常规病理的采用常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色，普通光镜观察、照相。用于电镜的采用1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，Epon812环氧树脂包埋，制备半薄切片定位后，超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，JEM-1200透射电镜观察，摄片。2结果2.1神经胶质细胞形态检测对照组：(1)大细胞体积大，多数呈圆形或椭圆形，少数呈三角形。神经胶质细胞少。(2)大细胞的细胞核呈圆形或椭圆形，核膜清晰；核仁一个，清楚，浓染；细胞质均匀；细胞膜边界清楚（图1）。实验组：(1)缺血再灌流3d，大细胞边界清楚，核固缩，细胞膜及核膜完整、清晰。神经毡增加（图2）。5d时，神经胶质细胞增多（图3）。7d时，部分细胞变为梭形和三角形，细胞数量极少，但胞体边界清楚，胞膜、核膜完整（图4）。(2)神经胶质细胞的形态与对照组相比较，无明显变化，但数量逐渐增加。(3)在各实验组中，均无炎性细胞。2.2糖原组织形态对照组室旁核大细胞的超微结构特征（图5）：(1)细胞核：核仁明显，形态正常，染色质均匀。核膜完整，边缘光滑，无皱襞，核孔复合体明显。(2)胞质：细胞器丰富。富含粗面内质网、滑面内质网和游离多聚核糖体。胞浆内有许多线粒体。溶酶体和高尔基体数量较多。富含糖原。有分泌颗粒。(3)胞膜完整、光滑。脑缺血组：随着再灌流时间的延长，室旁核大细胞与对照组比较，出现了形态学改变。3d组：(1)细胞核：核仁一个，明显，形态正常。核染色质稀疏不均匀，核变形不明显。核膜双层不明显，出现部分水肿，边缘毛糙。(2)滑面内质网扩张，线粒体嵴不清或消失，甚有空泡状。(3)细胞膜完整，光滑（图6）。5d组：(1)细胞核：核仁一个，明显，趋边。边缘不太光滑。核基质稀疏，并出现颗粒状结构。核膜部分肿胀，出现明显皱襞，不光滑，但完整。核膜凹陷，变形明显。(2)胞质：线粒体由椭圆形变为长形，体积变大，嵴消失。(3)细胞膜部分肿胀（图7）。7d组：(1)细胞核：空泡化严重，核膜向核内凹陷显著，核膜完整。(1)胞质：胞质空泡化严重。部分区域出现细胞器解体。(3)胞膜完整（图8）。3大细胞优化后的超微结构调查在遗传病例、特发性多尿征和损伤下丘脑-神经垂体轴实验中，Vutskits等报道了室旁核加压素神经元的选择性死亡，但应用缺血再灌流方法对下丘脑室旁核进行实验研究的文献报道甚少。本实验中，双侧颈总动脉阻断法对下丘脑室旁核产生了影响，引起室旁核内大细胞形态改变，神经胶质细胞增加。有报道指出，脑缺血再灌流24h前，即使最易损伤的海马CA区锥体细胞也不出现明显的形态或数量的变化。本实验中室旁核的形态学改变出现在再灌流3d组，7d组变化明显，大细胞胞体由大变小，核固缩；神经毡不断扩大，细胞膜、核膜完整，神经胶质细胞数量逐渐增多。结果表明，虽然双侧椎动脉正常供血，但双侧颈总动脉阻断再灌流也会引起室旁核出现形态学改变。Ishimaru等用缺血缺氧研究了兴奋性神经元凋亡，并通过超微结构观察和DNA片段分析证实凋亡存在。Loesch在缺血10min后，对下丘脑分泌性核团进行超微结构观测认为其神经分泌细胞发生了凋亡的特征性改变。本实验中，大细胞细胞膜始终保持完整，神经胶质细胞数量不断增加，无炎症反应；大细胞从缺血第3天开始出现核膜双层不明显，滑面内质网扩张，线粒体嵴不清或消失，到第7天，核膜虽完整，但部分核膜向核内明显凹陷，胞核、胞质严重空泡化，部分细胞器解体。但是，既没有出现明显的凋亡小体，也没有典型坏死的结构性改变，其原因可能是仅结扎双侧颈总动脉，而没有堵塞双侧椎动脉，室旁核的形态学改变是不完全性缺血造成的。本文结果表明大鼠经历脑缺血再灌流后，室旁核大分泌细胞出现超微结构的动态变化。细胞核的变化反映了大细胞变化的趋势。我们发现：在缺血再灌流过程中，核仁的变化不太明显，而核基质和核膜变化较明显。对照组中神经元的核基质均匀，核膜无明显皱襞。再灌流后3天，核基质稀疏，核膜出现部分水肿，边缘毛糙。第5天时核仁出现趋边，核基质内出现空泡化和颗粒状结构，核膜凹陷明显。到第7天时，核基质的空泡化严重，核膜皱缩更加明显，部分核膜解体，核膜与胞质之间出现裂隙。该结果显示：在受到缺血再灌流的刺激下，大细胞细胞核的变化首先是核膜和核基质的形态改变。对于核膜的变化，主要表现为皱襞的出现和加重。核基质首先是稀疏，接着出现颗粒状结构，后表现为空泡化。Walski等在对10min临床死亡的大鼠下丘脑的分泌性核团进行超微结构观测时发现：细胞在出现选择性死亡前，包括出现明显的内核前，核基质会聚集成小团，以便于核膜的分散包裹。至于核仁的趋边，是否为以上现象的前兆值得进一步探讨。细胞器变化的先后顺序是从滑面内质网扩张和线粒体嵴不清或消失开始的，细胞质空泡化次之，后出现部分细胞器的解体。在缺血再灌流后第3天，滑面内质网扩张，线粒体嵴不清或消失。第5天，线粒体由椭圆形变为长形，体积变大，嵴消失。第7天时细胞质空泡化严重。部分区域出现细胞器解体。经历缺血再灌流后，室旁核大细胞出现了早期的形态学改变。神经元受到不良刺激后，起始阶段的形态学变化表现为细胞表面特化结构消失，细胞间接触消失，但细胞膜完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网腔膨胀；染色体固缩，