一起新布尼亚病的病原学检测

一起新布尼亚病的病原学检测

新布益病毒引起的发热和血小板减少综合征（gsh）是一种新发染疾病，也被称为新布益病毒。发病季节为4月至10月，5月至7月为5月至7月，这与蜱虫活动的高峰一致。一些人认为，这种疾病是由病毒引起的发烧和出血疾病。长角血虫被认为是病毒的传播源。由病毒引起的感染是传播的边缘，而与患者接触也是传播的边缘。本研究发现一例新布尼亚病毒致发热伴血小板减少症的死亡病例,流行病学调查发现该病例的感染与发病时间在2013年2月中下旬,无蜱虫叮咬,也无与病人接触史。病例急性期血液无形体DNA检测阴性,新布尼亚病毒抗原与核酸RNA检测均为阳性,从病例血清中成功地分离到病毒并检测到新布尼亚病毒基因组的三个特异性基因节段(L、M、S),基因核苷酸序列比对结果与GenBank登录的新布尼亚病毒核苷酸序列同源性在94%~100%。从临床症状和病原学检测鉴定结果显示该病人符合新布尼亚病毒感染致发热伴血小板减少综合征的确诊条件。通过对该病例的病原学鉴定与流行病学分析,提示新布尼亚病毒感染致发热伴血小板减少综合征的感染与发病时间不限于春季、夏季和秋季,传播途征除了蜱虫叮咬、接触病人的血液及血性分泌物外还可能存在其他途征。1材料和方法1.1材料表面1.1.1样本的来源与临床症状1.2方法1.2.1病毒核电厂检测2结果2.1新布尼亚病毒的负载量测量2.3新布尼亚病毒的鉴定2.3.1新布尼亚病毒的抗剂性鉴定2.3.3新布尼亚病毒的核糖酸序列的测定与颗粒比的比较3病例的流行病学特征经过数年的研究,以下的观点已得到大家的认可:新布尼亚病毒是发热伴血小板减少综合征最主要的病原体;蜱虫是该病毒的传播媒介;蜱虫叮咬以及与急性期病人的血性分泌物接触是目前已知的传播途径;潜伏期7d~14d;流行期在4月-10月,高峰期5月-7月。按中华人民共和国卫生部颁发的《发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)》(以下简称《指南》)的诊断标准,本病例临床表现与血常规、尿常规、血生化数据均符合发热伴血小板减少综合征疑似病例,新布尼亚病毒核酸检测连续4次阳性;从病例血清标本中分离到新布尼亚病毒等检测鉴定结果均符合确诊病例的诊断条件,值得探讨的是该病例的流行病学史与指南不十分相符,以下3个流行病学特征应引起关注:①该病例的发病时间为2013年3月1日,感染时间应在2月15日-2月22日,至今未见有更早的病例报道,可能是目前发病时间最早的新布尼亚病毒致发热伴血小板减少综合征确诊病例。②2月份岱山县的月平均气温6.1℃,仍属于隆冬季节,蜱虫处于蛰伏状态,病人也否认有蜱虫叮咬史,因此由蜱虫叮咬引起的传播途径的证据不足。③该病例是岱山县2013年SFTS的首发病例,据流行病学调查未发现该病例在发病前与发热及SFTS相似病人接触史,值得关注的是两个月后该村又发现一例无蜱虫叮咬史的SFTS确诊病例。④该病例家中未圈养牛、羊、狗、猫、鸡等家畜,通过上述家畜及寄生于它们身上的节肢动物传播途径的证据也不充分。从该病例的流行病学调查结果提示:传播媒介除蜱虫之外还有其他动物;传播途经也不限于蜱虫叮咬以及与病人急性期血液及血性分泌物接触;该病的感染与发病时间也不限于春季、夏季、秋季,冬季也可以发生。总之,SFTS是一种新发传染病,有许多流行病学特征有待去进行进一步研究、证实。病人赵某,女性,58岁。2013年3月1日发病,3月5日住院,3月13日因多器官衰竭死亡。主要临床症状:发热39℃、头晕、恶心、呕吐、乏力、腹股沟淋巴结肿大。3月7日临床化验主要指标有血常规:白细胞1.4×109/L、血小板56×109/L;尿常规:尿蛋白++、尿隐血+++;血生化:AST100U/L、LDH497IU/L、CKMB27IU/L,ALT与CK正常。3月12日的血常规:白细胞5.8×109/L、血小板63×109/L;血生化:AST1326U/L、LDH5625IU/L、CKMB528IU/L、ALT274U/L、CK17531IU/L、CREA170.9μmol/L;尿常规未化验。1.1.2血液样本的采集采集病人3月7日、9日、10日、12日血液样本4份,分离血清后置-80℃超低温冰箱冻存,用于新布尼亚病毒核酸检测与病毒分离。1.1.3细胞培养和荧光rt-pcr试验Vero-E6细胞由宁波市疾病预防控制中心赠送;细胞培养所有试剂及批号:MEM培养液(1237758);谷胺酰胺(08H21);胎牛血清(1014430);青霉素(09I26C16);链霉素(09I26C16);Hank氏液(13031204);0.25%胰酶(1227385);细胞培养方瓶(1020708);细胞培养板(12511016)均为美国GIBCO公司产品;RNA提取纯化试剂盒(QIAGENViralRNAMiniKit,74104,145019088);荧光RT-PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司,RR064A,AK2801];羊抗人IgG荧光抗体(美国ProteintechGroup公司产品,72944);实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司产品);荧光显微镜(德国ZEISS公司AXIO-VERT25);倒置显微镜(宁波光学仪器公司产品);二氧化碳培养箱(日本三洋MCO-15A)。病毒核酸定性与定量检测采用实时荧光定量RT-PCR方法,引物、探针序列与反应体系等可参考虞吉寅等报道的方法。1.2.2双环安插时,把放置于一般施肥的人放置参照刘芸、杜燕华报道的基础上进行优化,取新型布尼亚病毒核酸检测阳性病人的急性期血清300μl加30μl双抗(青霉素与链霉素的终浓度分别为1000U/ml与1000μg/ml),4℃放置过夜或37℃1h。将除菌过的血清标本接种于细胞生长至70%~80%的单层Vero-E6细胞的24孔细胞培养板中,同时在每块细胞板中设置一孔未接种血清标本的正常Vero细胞为空白对照,然后置细胞板于37℃培养箱中,每隔15min轻摇几次,1h~2h后弃去液体,再用Hank氏液洗2次~3次,加入胎牛血清含量为1%的MEM维持液,放置于37℃的烛缸内(CO2浓度约5%)培养2周后取冻融3次的细胞培养液上清盲传至第5d后,每天在倒置显微镜下观察细胞病变,当病变达到70%以上时取病变细胞培养液检测新型布尼亚病毒核酸,并作初步鉴定。1.2.3病毒核酸的检测①在Vero-E6细胞上是否有特异性的细胞病变。②同一份样本培养前后的荧光RT-PCR检测Ct值是否有明显的缩小。③用荧光定量RT-PCR检测细胞培养液中新布尼亚病毒核酸的Ct值<20时(病毒浓度已达到>108/ml左右),提示已分离到病毒,可以对病毒作进一步鉴定。若不符合上述三个条件则需再盲传一代。1.2.4gg抗体与荧光显微镜采用间接免疫荧光技术用于鉴定新布尼亚病毒抗原;即用已知的新布尼亚病毒IgG抗体(病人恢复期血清)作为一抗,异硫氢荧光素标记的山羊抗人IgG作为二抗,通过荧光显微镜来鉴定细胞中的新布尼亚病毒抗原,若细胞内有黄绿色荧光颗粒则说明有新布尼亚病毒存在荧光的亮度与病毒数量呈正相关。1.2.5新型布尼亚病毒的扩增产物采用中国国家传染病预防控制重点实验室提供的巢式RT-PCR检测分离到的新型布尼亚病毒L、M、S三个特异性基因,L基因的预期扩增产物长度为1020bp;M基因的预期扩增产物长度为678bp;S基因的预期扩增长度为601bp。1.2.6病毒测序结果对分离到的病毒株送基因公司作全基因序列测定,测定后的病毒核苷酸序列通过在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站BLAST栏目中的新型布尼亚病毒核苷酸序列进行比对,根据比对结果确定本次分离的病毒株是否为新型布尼亚病毒。1.2.7型布尼亚病毒的核苷酸遗传分析利用在Gen-Bank登录的中国各省新型布尼亚病毒代表株基因序列,通过DNAStar软件构建新型布尼亚病毒L、M、S三个基因节段的核苷酸进化树并作遗传特征分析。病人3月7日、3月8日、3月10日、3月12日的4份血清中新布尼亚病毒载量分别为4.65×101拷贝/μl、2.74×104拷贝/μl、1.01×105拷贝/μl、1.18×106拷贝/μl,病毒载量随着病情恶化快速增高。2.2细胞病变:d4份病人血清同时进行病毒分离,结果在3份血清中分离到新布尼亚病毒,病毒在Vero-E6培养14d(第一代)未出现细胞病变,第二代培养6d时有明显的细胞病变,病变细胞形态呈圆形、体积明显缩小、折光度增强(图1、图2)。从病人血清中分离到的病毒接种Vero-E6细胞作为抗原,用间接免疫荧光技术鉴定呈现典型的阳性结果,病毒分布于细胞浆,细胞膜部位病毒含量最高(图3)。2.3.2新布尼亚病毒的基因组织用中国疾病预防控制中心提供的巢式RT-PCR对分离到的新布尼亚病毒S、M、L三个特异性基因进行鉴定,鉴定结果显示符合新布尼亚病毒的基因特征(图4)。从病人赵某血清中分离到的新布尼亚病毒的全基因核甘酸序列长度为11470bp,其中L基因核甘酸序列长度为6368bp、M基因核甘酸序列长度为3378bp,S基因核甘酸序列长度为1724bp。BLAST比对结果是从病人赵某血清中分离到的新布尼亚病毒的S、M、L三个基因核甘酸序列(登录号:KF374683、KF374684、KF374682),与已在GenBank登陆的新布尼亚病毒同类基因核甘酸序列有高度的同源性,其中与KC189860、KC189859、KC189858的核苷酸序列相似度高达99.78%、99.78%、99.77%。2.3.4新布尼亚病毒序列基因进化树分析表明:本研究分离到的新布尼亚病毒S基因序列(KF374683)与国内