cf7l2基因多态性与2型糖尿病遗传易感性的关系

cf7l2基因多态性与2型糖尿病遗传易感性的关系

t2dm是一种异质性遗传疾病。在国外的许多研究中，tf7l2基因与t2d的发生密切相关，但尚不清楚中国汉族是否能够成为主要的2型糖尿病候选人。本研究探讨该基因SNPrs7903146、rs12255372在我国汉族人群中的分布情况及与T2DM遗传易感性的关系。对象和方法一、ho诊断标准1535例无血缘关系江苏地区汉族人中,根据1999年WHO诊断标准确诊为T2DM的患者682例,平均年龄63±13岁;糖耐量减低(IGT)者302例,平均年龄53±11岁;正常糖耐量(NGT)者551例,平均年龄46±11岁。二、pcr和fpg检测参数1.外周血白细胞DNA抽提:取EDTA抗凝血5ml,常规酚-氯仿法抽提基因组DNA。2.TCF7L2基因单核苷酸多态性分析:采用高温连接酶反应(LDR)技术,引物及探针序列见表1。多重PCR反应条件:20μl反应体系中含10×Buffer2.0μl,Mg2+1.2mmol/L,dNTPs200μmol/L,热启动Taq酶1U,上下游引物各0.5μmol/L,模板DNA约100ng。扩增条件:95℃预变性15min;94℃变性30s,59℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环;72℃7min。LDR反应条件:5μl反应体系中含探针各0.1rnmol/L10×Buffer0.5μl,热启动Taq酶0.05U,多重PCR产物1μl。循环条件:94℃2min;94℃40s,60℃2min,共35个循环。采用ABIPRISM377DNASequencer进行测序反应,Genemapper软件进行数据分析。3.临床检测及计算指标:所有受试者测量身高、体重,计算BMI;葡萄糖氧化酶法测定FPG;发光免疫法测定FIns。三、统计学处理方法计算TCF7L2基因型频率及等位基因频率,并确认其符合Hardy-Weinberg平衡。应用SPSS10.0统计软件,基因型及等位基因频率比较采用卡方检验,Logitic回归分析风险等位基因参与疾病发生的相对风险(OR),临床指标比较用one-wayANOVA方差分析或卡方检验。人群归因危险度(PAR)=[p(OR+1)]/[1+p(OR-1)],其中p为风险等位基因频率。结果一、各组的临床特点各组一般情况及FPG、FIns水平见表2。二、tp/cc结构SNPrs7903146为C/T多态,本研究所有样本均未发现TT型突变纯合子,故LDR反应产物长度(LDRlength)为82/82bp(CC纯合子)或82/85bp(CT杂合子)。SNPrs12255372为G/T多态,本研究所有样本也没有发现TT型突变纯合子,故LDR反应产物长度为88/88bp(GG纯合子)或88/91bp(GT杂合子)(图1)。本研究中应用LDR法rs7903146位点基因分型成功率为98.1%(1535/1565),rs12255372位点基因分型成功率为97.8%(1530/1565)。三、糖代谢异常组3.4基因型及等位基因频率分布1.在1535例汉族人中,共检测到CT基因型95例,C等位基因频率为96.9%,T等位基因频率为3.1%。2.T2DM组与IGT组CT基因型频率分别为7.2%和7.0%,均高于NGT组的4.5%,组间差异无统计学意义(与NGT组比较,P值分别为0.052和0.135)表3)。3.T2DM组及IGT组T等位基因频率分别为3.6%和3.5%,均高于NGT组(2.3%),但差异无统计学意义(与NGT组比较,P值分别为0.055和0.141)(表3)。4.糖代谢异常组rs7903146基因型及等位基因频率分布情况:将T2DM组与IGT组合并为糖代谢异常组,其CT基因型频率显著高于NGT组(P=0.044),T等位基因频率亦显著高于NGT组(P=0.048),差异有统计学意义(表4);T等位基因参与糖代谢异常发生的相对风险(OR)为1.589(95%CI=1.000～2.524),人群归因危险度(PAR)为2.1%。四、t等位基因频率本研究中共检测到17个GT突变杂合子,T等位基因频率仅为0.55%,远远低于欧美白种人及日本黄种人,且不构成SNP,未进行进一步分析。中国少数民族糖代谢异常人群的tcf7l2基因TCF7L2基因位于人类染色体10q25,其编码的蛋白质为β连环素的核受体,是介导WNT信号通路的关键蛋白,作为细胞内重要的转录因子调控胰升糖素原基因的转录,从而调节肠道L细胞合成胰升糖素样肽1。2006年Grant等首先报道TCF7L2基因与2型糖尿病的发生强烈相关,这一结果随后在多个人群中得到证实,研究发现TCF7L2基因参与白种人2型糖尿病发生的相对风险为1.5～1.6,远高于PPARγ、KCNJ11、Calpain10等既往较公认的T2DM易感基因(约1.15～1.30)。因此,TCF7L2基因一度被认为是目前继HLA后糖尿病遗传学研究领域最重大的发现。然而,在日本人群中TCF7L2基因尽管也与2型糖尿病的发生相关,但风险等位基因频率极低,同时在一些非洲人的研究中并未证实TCF7L2基因参与2型糖尿病的发生。SNPrs7903146为C/T多态,T为风险等位基因,本研究结果显示中国汉族糖耐量正常人群及2型糖尿病人群T等位基因频率分别为2.3%和3.6%,均显著低于白种人(分别约为30%和40%),与日本人非常接近,与北京大学、香港及中国台湾报道的结果一致。SNPrs12255372为G/T多态,T为风险等位基因,本研究人群T等位基因频率仅为0.55%,也远远低于白种人和日本人。以上结果提示TCF7L2基因该两个多态具有明显的种族特异性。在本研究中,T2DM人群TCF7L2基因rs7903146位点T等位基因频率明显高于NGT人群,但差异无统计学意义(P=0.052),但尚不能完全肯定TCF7L2基因与中国汉族T2DM无关。因为在本研究T2DM人群中T等位基因频率仅达3.6%,据此推算需要近千例的样本量才能达到80%的统计效力,因此如果进一步扩大样本量可能会得到阳性结果。同时,香港与中国台湾的研究发现TCF7L2基因rs11196218、rs290487与中国汉族人群T2DM相关。本研究在统计上将T2DM人群与IGT人群合并为糖代谢异常组,主要依据以下两个理由:其一,本研究中IGT人群与T2DM人群临床特征相似,T等位基因频率几乎一致(分别为3.5%和3.6%);其二,在DM的自然病程中IGT是公认的T2DM前期病变,若不加干预,多数患者会转归为T2DM,可近似认为两者是同一疾病的不同发展阶段,具有同质性。合并后结果发现糖代谢异常人群TCF7L2基因rs7903146位点CT基因型频率及T等位基因频率均显著高于NGT人群,统计学差异具有显著性,T等位基因参与疾病发生的相对危险度达1.589,由于风险等位基因频率较低,其人群归因危险度仅达2.1%,也明显低于欧美白种人。据此,本研究谨慎地认为TCF7L2基因rs7903146位点T突