表观遗传调控在肿瘤发生发展中的作用

表观遗传调控在肿瘤发生发展中的作用

表内遗传（epigen主义）指的是影响遗传因素的个体行为（可以通过dna序列进行更改）的调节，以及允许继承的（可以随着细胞分裂的传递），包括dna甲基化、组蛋白改变、染色重建、mirna、病毒等。表观遗传调控在干细胞自我更新、定向分化、器官发育等生命过程中起着至关重要的作用:每一个多细胞生物个体都是由一个受精卵细胞发育分化为成千上万个种类繁多、形态功能各异的体细胞,但这些细胞都携带着基本一致的遗传信息———DNA序列[除T细胞和B细胞发生过V(D)J重组之外]。而且,通过核移植、细胞融合或诱导特定基因表达等方法人工诱导的细胞重编程过程也基本不涉及DNA序列改变,也就是说要通过表观遗传机制。表观遗传调控过程一旦出错则会引发多种疾病,如癌症和多种内分泌疾病。因此,深入细致地理解表观遗传调控机制有着深远的科学和社会意义。本文主要讨论的是3种在染色质基础上的表观遗传调控(chromatinbasedepigenetics)——DNA甲基化、组蛋白共价修饰和染色质重塑在肿瘤发生发展中的作用,包括其证据、机制以及临床应用。这3种调控过程都是由多种具有酶活性的蛋白(或复合物)调控,这些蛋白在正常的干细胞自我复制及分化发育过程中有着重要功能,而其突变或表达异常则易导致肿瘤等多种疾病。1基因重排cdh方面的肿瘤DNA甲基化主要发生在CpG双核酸位点。通常DNA甲基化会抑制所调控基因的表达,从而在组织特异性基因沉默、基因组印记及染色体稳定性维持等过程中发挥重要功能。DNA甲基化酶包括DNMT1(维持甲基化)、DNMAT3a以及DNMT3b(催化新的甲基化),而最近发现甲基化的CpG可以被TET家族的蛋白水解。以下证据显示了DNA甲基化在肿瘤发生发展中的重要作用。首先,正常细胞内,启动子区的CpG岛(长度为300~500bp,富含CpG)呈非甲基化状态,而大部分散在分布的CpG二核苷酸多发生甲基化。肿瘤常伴随基因组整体甲基化水平降低和某些基因CpG岛区域甲基化水平异常升高(如抑癌基因),而且这两种变化可以在一种肿瘤中同时发生。一方面,基因组整体甲基化水平降低,有利于有丝分裂重组,从而导致缺失和转位,并可诱导染色体重排。此外,基因组整体甲基化水平降低还可导致原癌基因活化(如IGF2的活化导致Wilms癌症)、转座子的异常表达、基因组不稳定等,这些因素均促进了肿瘤的发生。另一方面,基因启动子区的CpG岛发生异常高甲基化,可导致基因转录沉默,使重要基因,如抑癌基因、细胞周期调节基因、凋亡基因等表达极度降低或不表达,进而也促进了肿瘤的发生。例如,Baylin实验室早在1994年就观察到约60%的肾癌起因于肿瘤抑制基因VHL的失活性突变,同时也观察到在约20%的非VHL突变肾癌样本中,VHL启动子序列的高度甲基化导致该基因的表达被完全抑制;随后,该实验室又观察到P16也可以由于其启动子高度甲基化而被抑制,从而导致很多种肿瘤的发生。近期人们还发现,表观遗传和遗传也可以互相配合,抑制抑癌基因从而导致肿瘤的发生。例如,抑癌基因的一个等位基因因突变而失活,另一个等位基因则可能是因为启动子甲基化而被抑制表达。其次,异常的DNA甲基化还会导致某些抑制细胞转移的基因表达被抑制,进而促使肿瘤发生转移。这些转移相关基因包括钙粘附蛋白(E-cadherin)基因、乙酰肝素硫酸盐合成途径、蛋白酶类组织抑制剂、轴突生长导向分子、血小板反应蛋白(thrombospondins)和层粘连蛋白等。最明显的是E-cadherin基因(CDH1):某些原发肿瘤呈现E-cadherin超甲基化,但相应转移灶E-cadherin基因却未发生甲基化。这些结果显示,在原发肿瘤中E-cadherin表达缺失,但远端转移灶中E-cadherin表达可恢复。由此可见,转移细胞要正确整合入一个新的正常细胞环境,E-cadherin去甲基化和再表达是必不可少的。此外,基因内含子DNA,如LINE1和Alu重复序列被激活后,可转录或转位至其他基因区域并扰乱基因组。LINE1和Alu元件内较高程度的低甲基化与神经内分泌肿瘤和淋巴结转移相关。还有研究显示,许多具有高侵袭性或具有转移潜能的肿瘤中,某些基因呈现低甲基化,如SNCG和uPA/PLAU。影响DNA甲基化水平的多种酶,包括DNMT3a、TET蛋白的突变或失活也被证明与多种白血病有关。例如,急性髓细胞性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)和其他几种淋巴细胞白血病中发现MLL-TET1的异常融合。这些证据都提示了DNA甲基化在癌症发生和发展中的关键作用。2共价内纤维蛋白在基因组织中的作用8个组蛋白(2个H2A、2个H2B、2个H3、2个H4)和约146bp的DNA组成染色质的最基本单位——核小体。组蛋白上面的很多氨基酸可以通过各种翻译后的可逆的共价键修饰,包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等,形成理论上数目繁多的特定的“组蛋白密码”来形成“开放”或“关闭”的局部染色质结构,或是决定何种蛋白结合到特定DNA区域,从而调节多种DNA功能,包括转录、复制以及损伤修复。例如,组蛋白的H3K4、H3K36、H3K79三甲基化、H3K9和H3K14的乙酰化以及H4K20和H2BK5的单甲基化都导致基因激活,而H3K9的单/双甲基化和H3K27的三甲基化会抑制基因表达。更有意思的是,在胚胎干细胞(可能也包括其他细胞)内,“预备状态基因(poisedgenes)”有非常特异的“双调节码——H3K4和K3K27的三甲基化”,使得这些基因很容易被激活。迄今已发现数百种蛋白酶参与组蛋白共价修饰的精细调控。组蛋白修饰异常是肿瘤细胞的一个明显标志,例如,肿瘤细胞有着非常显著降低的H4K20的三甲基化和H4K16的乙酰化。而关于组蛋白修饰酶在肿瘤组织中的突变或表达异常的报道更是层出不穷,现在已知较多的是修饰组蛋白乙酰化和甲基化的酶在多种癌症中的突变,而其他类的酶与癌症的关系则还处于研究初期阶段,例如最近发现癌基因JAK2其实是一个组蛋白激酶。2.1e400和sv0t的突变数种组蛋白乙酰化酶基因的移位在许多种血液肿瘤中频繁出现,这些酶包括EP300、CREBBP、NCOA2、MYST3、MYST4等,而腺病毒蛋白E1A和SV40T结合组蛋白乙酰化酶EP300和CREBBP后可异常激活许多基因,导致细胞增殖分裂加快,从而在很多组织系统中引发癌变。有研究发现,EP300的突变和另一种组蛋白乙酰化酶KAT5的染色体移位可以大大增加结直肠癌、胃癌、乳腺癌以及胰腺癌的发病率。HDAC类和Sirtuins类两个家族的组蛋白去乙酰化酶都在很多类型的癌症中高表达,抑制它们的活性即可以抑制肿瘤生长。2.2ezh2的调节作用很多组蛋白甲基化酶和去甲基化酶也被发现与癌症发生发展密切相关。在许多种癌症中都有由于染色质移位、基因扩增或缺失、突变、融合、过表达或表达抑制等多种方式导致的酶表达水平或活性异常。例如,H3K4甲基化酶MLL在大于70%的新生儿白血病和5%~10%的成人AML、淋巴细胞性白血病中发生部分重叠性复制(partialtandemduplication,MLL-PTD)或者基因融合。和MLL异常有关的白血病往往对现有治疗方法不敏感,从而预后很差。已发现的可以和MLL发生融合的基因有80多种,其中一个关键机制是MLL和其他蛋白融合后引起的DOT1L,即一种H3K79甲基化酶,其结合到更多的位点可以导致很多促癌基因异常激活。另一个H3K4甲基化酶SMYD3高表达于结直肠癌和肝癌中,使细胞繁殖和恶变加强。NSD1是一个H3K36(还可能包括H4K20)甲基化酶,其与白血病、胶质瘤、神经母细胞瘤以及一种非常容易患癌症的Sotos综合征有关。但在这些组蛋白甲基化酶中,与癌症关联证据最多且最复杂的还是H3K27甲基化酶EZH2。EZH2是PRC2复合物的关键成分,通过影响基因表达而在干细胞自我复制、定向分化、器官形成等生命过程中起着非常关键的作用。EZH2起初被发现高表达于前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、皮肤癌和肺癌,其诱发癌症的机制为:EZH2对干细胞特异基因的激活以及对很多抑癌基因如P16、P27和BRCA1的调控等等。已有研究发现,抑制EZH2活性的确能在小鼠模型中抑制甚至完全阻断肿瘤的生长。在弥散性大B细胞癌中,EZH2的一个等位基因发生突变后和另一个等位基因表达正常的EZH2组合会出现更强的酶活性。而新近的研究却发现EZH2在25%的T细胞白血病中发生失活性突变。因此,根据不同的细胞环境,EZH2既可以是癌基因,也可以是抑癌基因。另一方面,关于组蛋白去甲基化酶在癌症中的研究也越来越多,例如:催化双甲基或三甲基化的H3K4去甲基化的JARID1家族的多个蛋白在多种癌症中高表达且很可能是致癌原因;对EZH2起拮抗作用的H3K27去甲基化酶UTX在很多癌症中发生突变;催化单甲基化或双甲基化的H3K4去甲基化的LSD1在乳腺癌中的表达缺失。研究表明,LSD1的表达可以抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移,并且影响转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ,TGFβ)信号传导,这表明LSD1是一个强效的抑癌基因,可能是干预乳腺癌转移的新的分子靶点。3swi/snf产物染色质重塑(chromatinremodeling)指的是在没有DNA和组蛋白共价修饰变化的情况下,染色质结构发生的变化,包括核小体的解体(DNA和组蛋白的分离)、移位、DNA-组蛋白之间亲和力的变化以及染色质三维结构的变化。染色质重塑通常是由一些能水解ATP产生能量的较大的复合物催化的,这些复合物包括SWI/SNF、ISWI、INO80等,它们通过影响染色质结构而调控转录、复制、DNA损伤修复等,从而在干细胞自我复制、分化发育、器官形成等过程中发挥重要作用。近几年研究发现,这些染色质重塑复合物,尤其是SWI/SNF复合物与多种癌症相关。SWI/SNF复合物在从酵母到人的所有整合细胞中都保守存在,影响基因表达、复制等基本DNA功能。哺乳动物SWI/SNF复合物包含8~12个成分,其组成成分(和具体功能)呈组织特异性以及发育阶段特异性。SWI/SNF复合物的ATP酶可以是BRG1或BRM其中之一,其他成分包括SNF5、BAF155、BAF170、ARID1a和BAF180等等。编码这些成分的基因在多种癌症中发生突变,其中最早发现与癌症有关且证据最多的成分是SNF5。早在1998年,Versteege等发现,突变基因SNF5反复出现在一种高死亡率的儿科恶性肿瘤——恶性柱状细胞癌(malignantrhabdoidtumors,MRTs)中,而且SNF5突变和MRTs的关系还具有家族性:有单个等位基因SNF5突变的家族容易发生另一个SNF5等位基因失活,从而发生癌变。随后,研究又发现神经鞘瘤(schwannomatosis)等多种癌症均存在SNF5突变。人为诱导SNF5在这些肿瘤细胞中表达,会导致这些细胞生长抑制。为直接验证SNF5的抑癌活性,我们构建了条件性SNF5缺失的转基因小鼠,研究发现,SNF5是一个非常强的抑癌基因,在小鼠模型中诱导缺失SNF5会导致恶性肿瘤,且越来越多的证据支持其他SWI/SNF成分也和癌症有很强相关性的结论。例如BRG1在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等癌症中缺失或突变;ARID1a在近50%的卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症中突变;BAF180在近半数肾癌中突变等等。4表观遗传调控基因的突变长期以来,人们普遍认为,癌症是一种“遗传性”疾病,即主要是由若干(至少2~3个)基因突变累积导致靶细胞持续增殖、凋亡失控、侵袭能力增强等变化从而癌变。然而,最近几年在以下几方面的研究进展,尤其是癌症基因组测序项目的实施,使得人们开始重新审视这一理论。首先,人们发现基因被激活或失活,并不一定要通过DNA序列改变,表观遗传调控失常也可和基因突变一样造成致癌后果。例如,基因编码区的突变可阻断抑癌因子VHL的表达从而造成恶性肾癌,然而即使很多患者没有VHL基因编码区的突变,该基因启动子高度甲基化也可以完全抑制VHL基因的表达而致癌。又比如很多癌变细胞里P16基因虽然序列正常,但其表达却受表观遗传抑制(例如其启动子高度甲基化或SWI/SNF功能缺失)而不能发挥抑癌功能。此外,很多在发育过程中起重要作用的信号传导通路,包括WNT、Hedgehog和TGFβ等的关键成分突变亦可导致癌变。最近几年的研究表明这些信号传导通路也可以通过表观遗传的方式调控,例如北京大学基础医学院尚永丰实验室发现LSD1可以调节TGFβ信号通路,我们实验室也发现SNF5和Hedgehog信号通路关系密切,这些证据都表明遗传(DNA序列改变)和表观遗传两种方式可以导致同样的结果,这些研究奠定了表观遗传调控失常致癌的理论基础。其次,最近几年发展起来的测序技术使得人们有可能测定同一种癌症的多个样本的全外显子序列甚至全基因组序列,从而比较全面、彻底地发现致癌原因。这个项目除了发现人们熟知的癌基因或抑癌基因外,最令人吃惊的是发现了表观遗传调控基因的突变(包括DNA序列中碱基突变、缺失、移位、融合或多拷贝放大等)所导致的癌症种类数量之多及发生率之高远远大于人们以前的理解。多个表观遗传调控因子被发现在血液系统恶性肿瘤(包括各种白血病)、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤等多种癌症中以很高的比率出现。例如,SNF5基因在高达98%的MRTs中突变或缺失,而组蛋白甲基化酶MLL2的突变则在高达89%的滤泡性淋巴瘤和近30%的弥散性大B细胞淋巴瘤患者样本中被检测到。再次,虽然很多癌症患者的癌细胞中都有几十、上百甚至更多的基因发生突变,然而重要的问题是:究竟哪些是真正的致癌因素(drivers),哪些是癌变过程中导致的或根本就是随机的附带突变(passengers),这个问题长久以来没有得到解决。全基因组测序技术的快速发展为回答这个问题提供了强有力的支持——对同一种肿瘤的多个病例进行测序分析,如果有超过一定比例的患者都有某个基因的突变,则这个基因很可能就是这种癌症的致癌基因,而且这种“重复突变(recurrentmutation)”的基因数目越少,这些突变的基因越有可能是真正的致癌因素。近几年的癌症基因组测序研究都为表观遗传在癌症发生发展中的重要作用提供了大量的实验证据。仍以MRTs为例,这种死亡率极高、发展极快(通常从发病到死亡不到1年)且对现有治疗手段极不敏感的儿童肿瘤,其基因组却很稳定,没有任何染色质片段扩增或缺失,更没有整条染色体的增多或减少。几乎所有的MRTs都有SNF5基因的双等位基因失活性突变或缺失。我们实验室的一系列工作,尤其是近期对数十例MRTs样本的深度测序,发现MRTs除SNF5本身外,只有很少几个甚至没有其他基因发生突变,因此,MRTs可以说是第一个被发现的“表观遗传性”肿瘤,这也说明癌症可以是简单的、纯粹的表观遗传性疾病。又如在膀胱癌中,将近20%的“重复突变”基因的表达产物参与表观遗传调控。Nature杂志也曾报道,和以前的猜想完全相反,视网膜母细胞瘤也是一种“表观遗传肿瘤”,对该肿瘤的全基因组测序发现,除RB基因外,只有很少基因发生突变,但是很多基因却通过表观遗传方式被异常激活,因此,其致癌机制很可能是RB通过和染色质重塑复合物相互作用及影响DNA甲基化而激活SYK等癌基因。此外,儿童成神经管细胞瘤和Wilms’瘤也都呈现较高程度的基因组稳定性而少有基因突变,很可能是“表观遗传肿瘤”。另一个确定真正致癌因子的方法是在体外或模型动物(最常用的是小鼠)人工诱导同样的基因突变,然后检测是否诱发同样的癌症。最好的例子还是SNF5,SNF5基因突变在98%的儿童MRTs以及其他数种恶性肿瘤中被检测到,而且还具有家族性:在丢失一个SNF5等位基因的家族中,其成员往往容易丢失另一个SNF5的等位基因从而导致MRTs。为了验证SNF5的失活的确是这些恶性肿瘤的癌变原因,我们和其他实验室制备了可诱导的SNF5条件性缺失小鼠。SNF5失活导致100%的小鼠在11周左右死于恶性肿瘤——主要是MRTs(和人的同类肿瘤在组织学和全基因组表达模式上都十分相似)和恶性的TCR依赖的成熟T细胞淋巴瘤。这些实验数据证明,SNF5的确是一个活性非常强的抑癌基因,其活性丧失能直接导致癌变。值得一提的是,SNF5的抑癌活性比任何已知的抑癌基因都强:P53失活致小鼠癌变的时间是20周(是SNF5失活导致癌变时间的2倍),P16等其他抑癌基因缺失导致的癌变则需要更长的潜伏期,而且癌变率并不是100%。其他表观遗传调控因子,如MLL和AF9等基因融合,MOZ-TIF2基因融合的致癌性也在动物实验中得到直接验证。最后,验证表观遗传在癌症发生发展中的作用还可以通过改变表观遗传调控活性能否阻断或逆转癌变过程。美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准的针对表观遗传的4个药物都在临床取得了很好的疗效。我们实验室利用转基因小鼠模型,发现了抑制Ezh2或Brg1的表达可以完全阻断SNF5失活所致恶性肿瘤的发生,证实了表观遗传调控因子在恶性肿瘤发生发展中的关键作用,也为这些分子作为潜在药物靶分子提供了直接的证据。5swi/snf信号通路突变越来越多的证据支持表观遗传在癌症发生发展中的关键作用,然而其作用的分子机制还很不清楚,有待进一步深入研究。第一,表观遗传通过影响基因表达,激活癌基因或抑制抑癌基因,例如表观遗传对VHL、P16和Myc等基因的调控。第二,表观遗传调控异常会导致染色质结构不稳定,从而引发染色体数目异常(aneuploidy)、大片段缺失或扩增以及DNA修复机制紊乱。第三,表观遗传可能影响细胞增殖或凋亡,例如Brg1/Brm缺失后,RB不再诱导细胞凋亡,其他SWI/SNF也和P53有密切关系。第四,表观遗传可能影响重要信号传导通路,如WNT、Hedgehog、TGFβ、细胞表面受体及许多激素受体等,这些信号通路在个体发育中具有关键作用,在癌变过程中也扮演重要角色。尽管这些研究刚刚起步,但已经得出一些证据——SWI/SNF和Hedgehog密切相互作用并且影响AR/ER信号、LSD1和TGFβ相互作用。我们还发现,SNF5缺失后会诱导非常恶性的依赖TCR信号的T细胞淋巴瘤发生。最后,表观遗传也能影响癌症侵袭和转移,例如LSD1可以显著影响乳腺癌的侵袭和转移能力,SWI/SNF也被证明与肿瘤转移有关。6dna序列变回正常的可行性人们曾经认为癌症是一种遗传性疾病,并花了相当大的人力、物力和时间来寻找合适的基因治疗方法,然而,实践证明,试图将一个突变的DNA序列变回正常的是非常困难的,迄今为止尚无一例成功;而表观遗传的改变却是可以调控、可以逆转的,认识到表观遗传在癌症发生发展中的关键作用,将对癌症的临床预防、诊断及治疗产生深远影响。6.1dna甲基化异常很多证据表明在癌变过程中,表观遗传变化先于DNA序列变化,且表观遗传相对容易调控和逆转,这为预防癌症提供了新思路。例如,很多致癌因素,如吸烟、酗酒、高脂饮食都能导致DNA甲基化的变化;慢性炎症和癌症的关系,尤其是消化道慢性炎症导致的食道癌、肝癌、结直肠癌等已为人们熟知,幽门螺杆菌或丙型肝炎病毒都能导致慢性炎症继而发展为癌症,而表观遗传在此过程中就起着重要的作用,包括DNA甲基化异常、表观遗传性的基因表达异常,尤其是一些细胞因子或信号传导蛋白(例如IL-B、TNFα、IL-8、TGFβ等等)的异常。因此,目前研究者们都在思考如何调控DNA甲基化以预防癌症。6.2用于肺癌患者的早期检测和预后的预测将表观遗传应用于癌症诊断主要集中在4个方面。(1)检测癌细胞,DNA甲基化异常和癌症的相关性已为人们广泛接受,随着近几年测序技术的惊人进步,全基因组的甲基化检测变得更加容易,人们发现几乎每一种癌症都有其特有的“甲基化基因组模式”。目前的研究重点集中在发现这种癌症特有而正常细胞没有的全基因组水平DNA甲基化标记,并开发出简单、快速、灵敏、可靠的检测试剂盒。(2)针对高危人群(吸烟者、矿工、慢性炎症患者、污染严重地区、有癌症高发家族史等人群)的早期检测,这方面最好的例子是GSTP1基因启动子的甲基化发生在80%~90%的恶性前列腺癌患者血液中,但却与良性前列腺癌无关。(3)对预后的预测,目前癌症治疗中最关键的问题之一是如何对组织学相似的同型癌症患者进行预后分析,以确定治疗策略、选择治疗强度。目前已经发现多种表观遗传调控因子和多种癌症预后相关,例如组蛋白甲基化酶NSD1的活性与神经母细胞瘤、DARK和肺癌、EMPS和脑癌、CDKN2A和直肠癌预后相关等等。(4)对化疗效果的检测和评估,目前也是一个热门领域。6.3其他基因型及调控组蛋白甲基化药物比起DNA序列的变化,表观遗传的变化更容易调控和逆转,因此,近年来对表观遗传在癌症发生发展中的关键作用的发现让医学界极为振奋,也为新药研发提供了全新的、前景广阔的一类抗癌靶分子,因而,几乎每一个药物公司都建立了研究开发针对表观遗传调控的抗癌药的部门,或者建立了和表观遗传研究公司的紧密合作。迄今为止,美国FDA批准了4个针对表观遗传调控的药物:其中两个是针对DNA甲基化的DNMT抑制剂阿扎胞苷(维达扎,vidaza)和地西他滨(decitabine),它们被用于骨髓增生异常综合征及其并发的急性白血病;另外两个是针对组蛋白去乙酰化HDAC酶的伏立诺他(vorinostat)和罗咪酯肽(romidepsin),主要用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤;这4种药物的不足之处是缺乏特异性,即对所有的DNA甲基化酶或组蛋白去乙酰化酶都有抑制作用,因而毒副作用较大。目前正在研发其他针对某一个特定表观遗传调控因子,包括DNA甲基化酶、组蛋白修饰酶(乙酰化、去乙酰化